Potencial funcional (In vitro e In vivo) y tecnológico de Exopolisacáridos (EPS) producidos por bacterias bácticas

Abstract

En la presente Tesis doctoral se propuso estudiar, en primera instancia, la producción de exopolisacáridos (EPS) por parte de diferentes cepas autóctonas de la colección del INLAIN aisladas de diversos nichos ecológicos y, a partir de las cuales, se seleccionó Lactobacillus fermentum Lf2 por su capacidad de producir altos niveles de EPS. La misma fue aislada como flora alterante de queso Tybo elaborado en la región, el cual presentaba defectos gasógenos causados por el metabolismo heterofermentativo de esta cepa. Este EPS fue estudiado abordando diversos aspectos que, según consideramos, son fundamentales para comprender el comportamiento de este compuesto a los fines de proponer su aplicación como ingrediente alimentario, con un potencial doble rol tecnofuncional. Primeramente, se evaluaron las condiciones de producción de EPS a escala laboratorio, mediante la modificación de diferentes parámetros de desarrollo de la cepa (pH, temperatura, tiempo) en un medio semidefinido. Posteriormente, aplicando estrategias de diseño experimental, se modificaron aquellos factores con mayor influencia en la producción de este metabolito (fuente de nitrógeno, fuente de carbono y tiempo). A partir de esta optimización se logró un rendimiento de hasta 2 g/L en las condiciones estudiadas hasta el momento, duplicando la producción obtenida en condiciones no optimizadas.Por otro lado, se caracterizó el extracto purificado desde el punto de vista químico y estrucutral mediante metodologías adecuadas (RMN, SEC-MALS, GC-MS y HPLC), pudiendo dilucidar que el extracto de EPS está compuesto mayoritariamente por dos fracciones de polisacáridos: un β-glucano de peso molecular relativamente elevado (1,8x103 kDa), cuya undidad repetitiva es un trisacárido compuesto por glucosa (dos glucosas unidas mediante enlaces β(1,3) y una ramificación en el segundo monosacárido compuesta por una molécula de glucosa unida por enlaces β(1,2)), y otro heteropolisacárido de peso molecuar medio (90 kDa), cuya unidad repetitiva es un disacárido formado por glucosa y galactosa (la cadena troncal consiste en moléculas de galactosa unidas por enlaces α(1, 6), todas ellas con ramificaciones de glucosa unida mediante enlaces α(1,2)). Ambas fracciones están presentes en una proporción similar, de aproximadamente 40 y 45%, respectivamente, en el extracto purificado. Asimismo, fue posible detectar otra fracción polisacarídica, de peso molecular mediano que representa sólo el 10% restante, y cuya composición y estructura se desconoce hasta el momento de escribir este manuscrito.Desde el punto de vista tecnológico, se abordó el estudio de su influencia en la textura y características organolépticas sobre distintas matrices lácteas, como son el yogur y el queso Cheddar, cuando se lo incorpora como ingrediente alimentario. El EPS adicionado como extracto crudo le otorgó consistencia y dureza a los yogures (en concentraciones de 300 y 600 mg/L), aumentando su pseudoplasticidad, con un leve efecto sobre la sinéresis y la organolepsis, indicando una suave interacción de la estructura polisacarídica y los componenentes de la matriz láctea (micelas de caseína, principalmente). En el caso de los quesos Cheddar, el extracto adicionado en un nivel de 1 g/L en la leche de elaboración no tuvo impacto significativo en la textura del producto final. Por otro lado, se estudió el rol funcional de este extracto de EPS incorporado a dos matrices lácteas, leche y yogur, mediante tres modelos in vivo (ratones BALB/c): estudio de su capacidad de protección frente a una infección por Salmonella enteritidis serovar Typhimurium; estudio de su rol inmunomodulador a nivel intestinal; y estudio de su rol probiótico/simbiótico sobre la microbiota intestinal, en forma individual y combinando el EPS con Bifidobacterium animalis subsp. lactis INL1, una cepa aislada de leche materna y con efectos probióticos ampliamente demostrados. A partir de estos ensayos se puso en evidencia la capacidad de proteger a los animales frente a una infección por Salmonella cuando se lo administró en leche, en una dosis de 9 mg/kg/día durante 25 días. Asimismo, se observó un rol inmunomodulador suave, mediado por IgA y por IL-6 (aumentaron los niveles de IgA en fluido intestinal, y disminuyó la citoquina proinflamatoria IL-6 en intestino delgado), en una dosis de 4,5 mg/kg/día durante 15 días de tratamiento, que se corresponde con la respuesta generalmente observada para polímeros de relativamente bajo peso molecular (~ <103 kDa), como el extracto de EPS estudiado. A partir del estudio de su rol prebiótico/simbiótico, cuando se lo administra como ingrediente alimentario en yogures (dosis de 9 mg/kg/día, durante 25 días), se observó un aumento en la producción de ciertos ácidos grasos de cadena corta (ácidos acético y butírico) y en los niveles del grupo Clostridium coccoides a lo largo del tratamiento por parte del EPS individualmente, así como un efecto bifidogénico cuando se lo combinó con la bifidobacteria.Otro objetivo planteado para esta Tesis, y que surgió a partir de una colaboración con el Prof. Paul O?Toole (UCC, Irlanda), fue estudiar el/los cluster/s genético/s involucrado/s en la síntesis de EPS de L. fermentum Lf2. Para esto, se comenzó por secuenciar el genoma bacteriano y, mediante análisis bioinformáticos, se logró ensamblar el genoma y encontrar genes que codifican enzimas que participan en la síntesis de EPS. A partir del concocimiento de la secuencia genómica (aún en formato draft), se pudieron identificar muy recientemente 3 clusters genéticos involucrados en la síntesis de EPS, ubicados en diferentes posiciones del genoma, lo que hace de L. fermentum Lf2 una cepa con características muy particulares, diferente a lo reportado para esta especie bacteriana. Asimismo, y debido a la importancia de contar con una variante de esta cepa incapaz de producir EPS, se construyó una mutante knockout (KO) para un gen codificante de una enzima clave en el proceso de síntesis de heteropolisacáridos, la glicosiltransferasa cebadora pGT1 (ORF 119, cluster 1). En referencia a este estudio, a pesar de que se pudo eliminar este gen, la cepa KO fue fenotípicamente similar a la wildtype. En base a lo expuesto, se puede concluir que L. fermentum Lf2, una cepa autóctona de nuestra región de influencia, tiene una particular relevancia en relación a su elevado rendimiento en la producción de EPS (cercano a 2 g/L, constituido mayoritariamente por dos fracciones polisacarídicas de elevado y mediano peso molecular), que fue capaz de aportar, como ingrediente alimentario, un doble rol tecnológico y funcional, mejorando la textura de la matriz donde se aplica y ejerciendo ciertos beneficios a la salud del consumidor (protección frente a una infección, rol inmunomodulador y rol prebiótico/simbiótico).Finalmente, caber remarcar la relevancia de esta cepa, aislada a partir de un evento negativo de la industria láctea y que ha demostrado diversos aspectos positivos a partir de este estudio, todos vinculados a la producción de una combinación de homo y heteropolisacáridos, una característica inédita, al menos, para cepas de L. fermentum.