Gelificación de proteínas de caupí del Nordeste Argentino

Abstract

El caupí (Vigna unguiculata) es una leguminosa perteneciente a la familia Fabaceae, cultivada en el nordeste argentino por pequeños y medianos productores. Se lo utiliza como abono verde, en sistemas rotativos con otros cultivos anuales o en plantaciones frutales, para aumentar o mantener la fertilidad del suelo. Además esta legumbre posee un elevado contenido de proteínas (24,3 a 27,1%) de buena calidad nutricional. El caupí se puede considerar como una fuente de proteína vegetal poco explotada que podría introducirse como alimento ya sea en forma de grano entero o de sus derivados.Los aislados proteicos de caupí (APC) pueden ser incorporados en la formulación de alimentos siempre que posean adecuadas propiedades funcionales. El objetivo general de esta tesis fue estudiar en profundidad la capacidad de gelificación de APC bajo distintas condiciones, de manera de obtener información que permita incorporar estas proteínas de alto valor nutricional en alimentos destinados al consumo humano.Se caracterizaron las propiedades fisicoquímicas y funcionales de las proteínas de dos APC (A8 y A10, llamados según su pH de extracción, pH 8,0 y pH 10,0 respectivamente) y se evaluó el efecto de tratamientos térmicos (TT) y tratamientos con altas presiones hidrostáticas (TAPH) sobre las mismas. La concentración proteica empleada durante los tratamientos en esta etapa del trabajo fue relativamente baja (1% p/p de proteína) para evitar una agregación masiva, coagulación o gelificación. Los TT aplicados fueron a 70 o 90 °C, variando el tiempo (5, 10 o 30 min). Los TAPH se aplicaron a 200, 400 o 600 MPa durante 5 min. Los aislados no tratados y tratados se liofilizaron y analizaron a través de SDS-PAGE, fluorescencia intrínseca, hidrofobicidad superficial, y propiedades térmicas, agrupadas como propiedades fisicoquímicas; solubilidad, capacidad de retención de agua (WHC), viscosidad aparente y concentración mínima de gelificación (LGC), agrupadas como propiedades funcionales. Además, se estudió in situ el efecto de APH sobre la estructura terciaria de las proteínas, realizando espectros de absorción en el UV y espectros de emisión de fluorescencia cuando las dispersiones proteicas se encontraban sometidas a APH.Las proteínas de caupí fueron sensibles a las distintas condiciones a las que estuvieron expuestas, desde la preparación de los APC hasta los tratamientos desnaturalizantes (TT o TAPH). El pequeño grado de desnaturalización que presentó A10 a causa del cambio de pH durante la extracción produjo diferencias significativas con respecto a A8 en varias propiedades, principalmente en la hidrofobicidad superficial y también en la sensibilidad a los TT y TAPH. Estos aislados presentaron semejantes propiedades de solubilidad, WHC y viscosidad aparente, pero se diferenciaron en su capacidad de gelificación, en que A10 mostró mayor capacidad que A8.Los TT y los TAPH indujeron cambios más drásticos en las propiedades fisicoquímicas y funcionales de A8 que en las de A10. La alta solubilidad en agua de los APC tanto antes como después de los tratamientos fue una característica destacable en el contexto de las proteínas vegetales. La solubilidad de A10 no cambió significativamente luego de los tratamientos y en muchas condiciones ensayadas fue mayor al 90%, en A8 se encontró el menor valor (72%) con el TT a 70 °C. Los TAPH fueron más eficientes que los TT para mejorar ciertas propiedades funcionales, como la LGC y la WHC de ambos aislados. Se estudió el proceso térmico de gelificación de los APC y el efecto del pre-tratamiento con altas presiones hidrostáticas (APH) y de la incorporación de calcio sobre el mismo. Se determinaron condiciones críticas de gelificación (concentración y temperatura) y se relacionó con las propiedades térmicas de las proteínas de los APC. Además se evaluó el efecto de la concentración proteica, la temperatura y velocidad de calentamiento y enfriamiento del TT sobre el comportamiento reológico.La capacidad de formar geles térmicos de los APC fue semejante a la de otras proteínas vegetales de reserva en términos de concentración crítica. Sin embargo, las proteínas de caupí presentaron una importante capacidad de establecer interacciones entre sí por lo que la gelificación térmica comenzó antes de que se alcanzara un alto grado de desnaturalización, lo que las diferenció de otras proteínas vegetales. Las propiedades reológicas de los geles obtenidos dependieron de la concentración proteica, la temperatura del TT y la velocidad de calentamiento y enfriamiento. A10 necesitó menor concentración que A8 para formar un gel. A las menores temperaturas (70 y 80 °C) A10 generó geles más elásticos que A8, mientras que a las temperaturas más altas (90 y 95 °C) las diferencias entre A8 y A10 se cancelaron, probablemente por el mayor grado de desnaturalización. Los valores de G´ al final del ciclo sugieren que en las condiciones estudiadas de concentración proteica y fuerza iónica se pueden obtener geles de APC con buenas características reológicas con tratamientos térmicos a 80 °C, una temperatura relativamente baja para la gelificación de proteínas vegetales. La matriz de los geles estuvo principalmente estabilizada por interacciones favorecidas por el enfriamiento como puentes de hidrógeno.El pre-tratamiento con APH a bajas concentraciones proteicas no favoreció la gelificación térmica, pero aumentó las interacciones entre las proteínas durante el calentamiento dando soluciones más viscoelásticas En cambio a altas concentraciones (a partir de 10,5% p/p) el pre-tratamiento con APH permitió obtener geles térmicos a menores temperaturas (50 o 60 °C dependiendo del nivel de presión utilizado). A partir de 90 °C, el fortalecimiento en A10 fue de gran magnitud solo a 400 MPa, mientras que en A8 no se detectaron cambios significativos con ningún valor de presión. En los geles obtenidos con pre-tratamiento con APH la contribución a G´ generada durante el enfriamiento fue menor que en los no pre-tratados. Esto sugiere que las APH permitieron aumentar la proporción de interacciones hidrofóbicas en los geles térmicos, probablemente por el aumento de la hidrofobicidad superficial generado por el TAPH.La presencia de calcio durante el proceso térmico de gelificación permitió obtener geles a menor concentración proteica pero con ciclos térmicos de altas temperaturas. Los iones calcio favorecieron el establecimiento de interacciones que no necesitan alto grado de desnaturalización (interacciones tipo iónicas dependientes de calcio), pero para alcanzar una matriz viscoelástica suficiente para formar un gel se requirió la desnaturalización proteica para establecer interacciones durante el calentamiento (del tipo hidrofóbicas). A bajas concentraciones (7,5% p/p) las diferencias entre A8 y A10 se cancelaron a temperaturas menores o iguales a 80 °C, a mayor temperatura (90 y 95 °C) las diferencias se evidenciaron.La selección de uno u otro aislado dependería de las características texturales que se deseen obtener y las temperaturas a las que se deba someter el producto alimenticio, la elección de A10 sería ventajosa en la preparación de alimentos en que se requiriera aplicar TT de baja intensidad.Finalmente se analizaron las características de dispersiones proteicas de A10 a diferentes concentraciones sometidas a TT o a TAPH, cada uno en dos niveles, 70 o 90 °C, y 400 o 600 MPa. Se evaluó el efecto de la concentración proteica y se caracterizaron los geles obtenidos. Además se estudió el efecto de la incorporación de calcio variando la concentración entre 0 y 40 mM trabajando con la menor concentración proteica (7,5% p/p).Se pudo lograr la formación de geles débiles de A10 a partir de 10,5% p/p con TT de 20 min a 70 °C y a partir de 9,0% p/p con TT de 20 min a 90 °C. Con ambas temperaturas de TT el aumento de la concentración proteica produjo geles térmicos más fuertes y duros con muy alta WHC, sin diferencias significativas en la dureza y WHC por el aumento de la temperatura. La gelificación por APH requirió mayor concentración proteica que la gelificación térmica (a partir de 13,5% p/p al aplicar 400 MPa y a partir de 12% p/p al aplicar 600 MPa). El efecto de la concentración proteica no se pudo evaluar ya que el rango de concentraciones empleado generó solo uno o dos geles auto-portantes. Las propiedades de los geles obtenidos por TAPH fueron función del nivel de presión utilizada. Los geles a 600 MPa presentaron dureza y viscoelasticidad semejante a la de los geles térmicos, mientras que los geles a 400 MPa fueron más débiles. Los geles obtenidos por APH presentaron una matriz proteica compacta y homogénea como los geles térmicos pero con predominio de interacciones puente de hidrógeno y menor cantidad de puentes disulfuro. Las diferencias entre los tipos de tratamientos para lograr la gelificación probablemente se debieron a los diferentes fenómenos de desnaturalización-agregación. En el caso de los TAPH la mayor concentración y proximidad entre las moléculas sería el factor clave para generar una matriz viscoelástica ordenada de gel. Tanto los geles térmicos como los obtenidos por TAPH exhibieron una excelente WHC (mayor al 95% cuando fue evaluada en condiciones muy enérgicas).La presencia de calcio estableció interacciones nuevas entre las proteínas de tipo iónicas dependientes de calcio, logrando gelificar las proteínas de A10 a menor concentración proteica (7,5% p/p) tanto por los TT como los TAPH. Estas nuevas interacciones proteína-proteína se dieron a costa de interacciones proteína-agua por lo que los geles obtenidos fueron de tipo particulados o agregados, con baja WHC y sinéresis espontánea. Este comportamiento dependió de la concentración de calcio y del nivel de temperatura o presión utilizado. Los geles térmicos con baja concentración de calcio (10 y 15 mM) presentaron características de geles tipo mixto, con matrices con estructuras de filamentos finos y de agregados, buen comportamiento reológico y buena WHC. En cambio los geles obtenidos por TAPH mejoran su comportamiento reológico a altas concentraciones de calcio (30 o 40 mM) pero mantuvieron una baja WHC. La incorporación de calcio varió la tonalidad marrón/ámbar de los geles de caupí a tonalidades blanquecina debido a la insolubilización proteica.Los resultados obtenidos en esta tesis permiten concluir que la capacidad de gelificación de APC es muy versátil ya que la aplicación de TT y TAPH (tanto durante la gelificación o como pre-tratamiento), así como la incorporación de calcio modificaron las propiedades de los geles obtenidos. Esto representa un punto de partida para expandir el uso de proteínas de caupí mediante el desarrollo de nuevos productos con características texturales definidas. De esta forma se contribuye con información para la actual búsqueda de proteínas vegetales que reemplacen las de origen animal, lo que conduciría a beneficios tanto ecológicos como para la salud humana.