Neutralización de fosfolipasas A2 del veneno de Bothrops Diporus por flavonoides aislados de Nectandra Angustifolia: Entendiendo su mecanismo de acción

Abstract

Comprender la base científica y los mecanismos terapéuticos de las formulaciones a base de extractos de hierbas propias de la etnomedicina resulta esencial, ya que juegan un rol importante en las terapias alternativas y complementarias de uso frecuente en la población de menores recursos. En este trabajo, se estudió el efectoinhibitorio del extracto etanólico y una fracción enriquecida de Nectandra angustifolia (Schrad.) Nees & Mart. sobre el veneno de Bothrops diporus utilizando ensayos in vitro y estudios in silico. El material vegetal se colectó en San Isidro (Corrientes), el extracto etanólico se preparó por maceración y se fraccionó por cromatografía bioguiada en columna flash. La actividad alexitérica sobre las fosfolipasas A2 del veneno se evaluó por inhibición de la hemólisis indirecta en placas de agar sangre fosfatidilcolina. La inhibición de la citotoxicidad sobre la línea C2C12 del veneno de B. diporus se determinó pre incubando con el extracto entero y la fracción más activa obtenida. La identificación química fue realizada por HPLC-DAD y UHPLC-MS(QqQ)1. En paralelo se realizaron estudios de docking molecular seguidos de simulaciones de dinámica molecular para investigar los mecanismos de unión de los principios activos del extracto a la enzima fosfolipasa A2 (PLA2). También se estudiaron, por análisis de densidad electrónica, las interacciones claves responsables del evento de unión. Los resultados obtenidos indicaron que la fracción más activa inhibe el 100% de la actividad hemolítica indirecta de la PLA2 y un 80% la citotoxicidad del veneno, mientras que el extracto etanólico inhibe un 42%. El estudio de esta fracción por UHPLC-MS permitió identificar la presencia de cinco flavonoides glicosilados (FGs). Para explorar los modos de unión de los FGs aislados se realizó una búsqueda conformacional dentro del sitio activo de la enzima mediante docking molecular. Las poses de docking se agruparon por similitud y una representativa de cada grupo fue punto de partida para las simulaciones dinámicas. Se encontraron dos modos diferentes de unión estable (binding patterns) denominados (1) quercetin driven y (2) sugar driven, dependiendo del modo de anclaje al sitio activo de la enzima PLA2. Cuatro FGs fueron capaces de unirse al sitio activo, presentando distinto grado de anclaje al subsitio S1 y/o al S2 y solamente uno de ellos (quercetina-3-O-neohesperidosido) exhibió interacciones significativas en ambos sitios simultáneamente. Un análisis de densidad electrónica (QTAIM) sobre recortes de los complejos [PLA2-FG] permitió identificar las interacciones moleculares claves (enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas) que permiten explicar a nivel molecular las propiedades observadas en los ensayos in vitro. En conclusión, se presenta la primera evidencia de la interacción de flavonoides extraídos de N. angustifolia y la enzima fosfolipasa A2 botrópica, sugiriendo un mecanismo para explicar a nivel molecular el efecto alexitérico de los flavonoides del laurel amarillo.