Participación de AKAP350 en el establecimiento de la polaridad celular en estructuras epiteliales organotípicas y en la sinapsis inmunológica en células NK

Abstract

AKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejosproteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi. AKAP350 está implicada en laregulación de la dinámica de los microtúbulos y participa en el desarrollo de la polaridadmigratoria y la polaridad epitelial hepática. En este trabajo se analizó la participación deAKAP350 en el desarrollo de dos tipos de asimetría celular: la polaridad epitelial columnary la sinapsis inmune.En una primera instancia utilizamos cultivos celulares 3D de células epiteliales paraanalizar la relevancia de AKAP350 en el establecimiento y mantenimiento de la polaridadepitelial. Las células con expresión disminuida de AKAP350 (AKAP350KD) formaron quistespolarizados con una morfología anormal del lumen. La organización de células epitelialesen estructuras organotípicas con un único lumen requiere que las divisiones celulares selleven a cabo en forma simétrica respecto al plano del epitelio. Aún no se hancaracterizado completamente las vías de señalización que proveen conexionesmoleculares entre regiones específicas de la corteza celular y los microtúbulos del husomitótico, y que, por lo tanto, definen la orientación del huso mitótico. El análisis de lascélulas mitóticas mostró que las células AKAP350 KD presentaron un alineamientodefectivo del huso mitótico. EB1 es una proteína asociada a los microtúbulos queparticipa en la regulación de la orientación del huso mitótico en células epiteliales.Nuestros hallazgos indicaron que AKAP350 colocaliza en los polos del huso con EB1. Losresultados del análisis de la distancia mínima entre ambas proteínas por FRET fueroncompatibles con la interacción de ambas proteínas en dichas estructuras. Experimentosde co-inmunoprecipitación mostraron la interacción de EB1 con el dominio N- terminal deAKAP350, el cual es también el sitio de unión a la subunidad de la dinactina p150glued. Ladisminución de la expresión de AKAP350 generó una reducción de los niveles de EB1 enlos polos del huso y en los microtúbulos del aster. El aumento en los niveles de EB1 en lospolos mitóticos y en los microtúbulos del aster inducido por sobreexpresión de estaproteína compensó el efecto de la disminución de la expresión de AKAP350 sobre laorientación del huso. La deslocalización específica de AKAP350 del centrosoma, así comola interferencia en su interacción con EB1, indujeron fenotipos similares a los de AKAP350KD, respecto tanto a la localización de EB1 como a la formación del lumen. En estascondiciones también se observó una disminución de los niveles de p150glued en loscentrosomas y en los microtúbulos del aster. Concluimos que AKAP350 recluta a EB1 y2p150 glued a los polos del huso, asegurando la presencia de estas proteínas en losmicrotúbulos del aster y una correcta orientación del huso mitótico durante lamorfogénesis epitelial.Tanto EB1 como AKAP350 participan en la ruptura de la simetría durante elestablecimiento de la sinapsis inmune en célulasT no citolíticas. En una segunda etapa,realizamos experimentos destinados a evaluar la participación de AKAP350 en elposicionamiento de EB1 durante la adquisición de asimetría celular asociada a laformación de la sinapsis inmune citolíticaen células natural killer (Nks). Inicialmentecaracterizamos la presencia de AKAP350 en células YTS, una línea celular proveniente decélulas Nks. A partir de las mismas, se obtuvieron células con la expresión disminuida deAKAP350 (YTS AKAP350 KD). Se utilizó un modelo bien establecido de sinapsis inmunecultivando las células YTS en presencia de células derivadas de eritroleucemia (KT86).Hallazgos de nuestro grupo indicaron que AKAP350 participa en el desarrollo de lapolaridad celular en este modelo. En dichas condiciones, utilizando microscopía confocal,se determinamos que AKAP350 modula la localización centrosomal de EB1. En conclusión,demostramos que AKAP350 modula el direccionamiento del huso mitótico en célulasepiteliales a través del reclutamiento de EB1 hacia los polos y, consiguientemente, hacialos microtúbulos asociados a estas estructuras. En forma similar, AKAP350 también reclutaEB1 hacia el centrosoma durante el establecimiento de la sinapsis inmune citolítica encélulas NK. A través del reclutamiento de EB1 a los polos del huso mitótico, AKAP350interviene en el mantenimiento de la polaridad epitelial planar. La relevancia de lainteracción entre ambas proteínas en la reorganización de las estructuras subcelulareshacia el sitio de contacto con la célula blanco es un aspecto importante a investigar enfuturos estudios.