Biblioteca de Códigos de Barra genéticos de Phlebotominae de Argentina
Otros responsables
Fecha
Publicador:
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
Fecha de depósito:
8/05/2024
Fecha de creación:
01/04/2021
Clasificación temática
Palabras clave
Resumen
Secuencias de ADN, fragmento COI utilizado como código de barra genético, de los primeros ejemplares de la bilbioteca de códigos de barra genéticos de 19 especies Phlebotominae de Argentina. Estas secuencias fueron generadas en la tesis doctoral de SL Moya, son parte del proyecto PHLAR de la plataforma BOLD (aún no disponible) y están subidas a GenBank con los números de acceso PP620154-PP620288.
Métodos
Los flebótomos utilizados fueron seleccionados segun representatividad geográfica y taxonómica a partir los ejemplares capturados en la provincia de Misiones, y otros obtenidos por derivación provenientes de proyectos y estudios de foco llevados a cabo por la Red de investigación de las leishmaniasis en Argentina. Los flebótomos capturados se procesaron individualmente diseccionandose extremidades (patas y/o alas) para conservarse a modo de váuchers de tejido en alcohol para la posterior extracción de ADN. El resto del cuerpo fue aclarado para la observación y registro fotográfico de caracteres morfológicos bajo microscopio óptico binocular Carl Zeiss con cámara incorporada AxioCam ERc 5s. Las determinaciones se realizaron según la clave taxonómica de Galati (2018). Los ejemplares obtenidos por derivación fueron determinados por observación de caracteres morfológicos presentes en cabeza y genitalia.Una vez realizadas las determinaciones, se seleccionaron los ejemplares para la biblioteca teniendo en cuenta la especie, el sitio de captura y el estado del ejemplar que posibilitare una posterior revisión de los caracteres morfológicos. En el caso de los ejemplares obtenidos por derivación, cuya extracción de ADN se realizó a partir de cuerpo entero, se priorizaron aquellos que tuviesen registro fotográfico de los caracteres morfológicos de valor taxonómico. Extracción de ADN, amplificación y secuenciación: las extracciones de ADN genómico total se realizaron con kits comerciales INBIO HW ADN Puriprep-S y Transgen Biotech con modificaciones a partir de instrucciones del fabricante. El rendimiento de las extracciones fue evaluado mediante cuantificación con fluorómetro Qubit™ y amplificación por PCR del gen cacophony constitutivo del genoma de Diptera. La amplificación del fragmento barcode del gen COI se realizó según protocolo descrito por Hebert et al. (2003) utilizando los cebadores sentido LCO1490 y antisentido HCO219845. Los productos obtenidos se separaron en gel de agarosa al 2 % teñidos con SYBR® Safe DNA (Invitrogen, USA) y visualizados con luz azul de 470 nm. De cada producto amplificado se realizó la secuenciación de ambas cadenas de ADN complementarias en un equipo ABI 3730XLs (Macrogen, Korea) o en el Centre of Biodiversity Genomics (CBG), Universidad de Guelph, Canadá. Los cromatogramas de las secuencias sentido y antisentido se evaluaron según pureza y señal de los picos de fluorescencia de los archivos “.AB1”, generándose secuencias consenso de cada ejemplar con los programas Chromas Lite151 y MEGA-X v10. La identidad de las secuencias obtenidas se contrastó con las disponibles en las bases de datos online empleando las herramientas de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST-NCBI) y la plataforma BOLD.
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