Dinoflagelados toxígenos en el Mar Argentino: diversidad, abundancia y toxinas asociadas

Abstract

Los dinoflagelados comprenden el principal grupo de microalgas asociado con la producción de Floraciones Algales Nocivas (FANs) en ambientes marinos, principalmente debido a su capacidad de producir una gran variedad de compuestos tóxicos que, al ascender en la cadena trófica, pueden causar severos daños en la salud humana y de otros vertebrados. En las últimas décadas, los fenómenos de FANs han cobrado una connotación alarmante a nivel mundial debido a su aparente incremento espacio-temporal y a sus efectos devastadores en relación con la salud humana y aspectos socio-económicos, dando lugar al desarrollo de un gran número de estudios relacionados con ésta temática a nivel mundial. En la Argentina, los episodios más importantes de FANs han estado vinculados a la presencia de distintas especies de dinoflagelados, principalmente pertenecientes al género Alexandrium, que han ocasionado severos daños en la salud pública, causando la muerte de varias personas, mortandad de peces y perjuicios económicos. No obstante, en los últimos años se han detectado nuevas especies toxígenas y distintos grupos de toxinas desconocidos previamente en la región, sobre los cuales el conocimiento de su diversidad y distribución aún es limitado. El objetivo general de esta tesis doctoral fue profundizar el conocimiento sobre la diversidad, abundancia, dinámica espacio-temporal y perfil de toxinas de los dinoflagelados toxígenos presentes en distintas regiones del Mar Argentino. A tal fin se realizaron cuatro campañas oceanográficas a bordo de distintas embarcaciones entre los años 2012 y 2016, en las que se realizaron muestreos en un total de 122 estaciones. En cada una de ellas se colectaron muestras de botella y de red para el análisis del fitoplancton y ficotoxinas, según protocolos de muestreo específicos que permitieron relacionar las densidades celulares y las concentraciones de toxinas y así estimar la producción de toxinas por célula en ambientes naturales. Las muestras de fitoplancton se analizaron con microscopía óptica y electrónica de barrido. Adicionalmente, se realizaron análisis moleculares del género Alexandrium tendientes a evaluar su diversidad específica. El análisis de toxinas lipofílicas se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) acoplada con espectrometría de masa en tándem (MS-MS), mientras que las toxinas hidrofílicas se analizaron mediante HPLC por derivación post-columna y detección fluorescente. El grupo de los dinoflagelados se observó en el 95 % de las estaciones de muestreo, aunque en términos de abundancia solo representó el grupo dominante del fitoplancton en ocho estaciones. Las densidades máximas de dinoflagelados (~ 2 x106 cél. L-1) se observaron en la región norte del talud (40 °S) durante una floración de Prorocentrum cordatum. Otros representantes numéricamente importantes fueron distintas especies de los géneros Gyrodinium, Tripos y Protoperidinium, así como pequeños dinoflagelados desnudos (< 10 µm). En el presente estudio se detectó la presencia de 20 especies pertenecientes a cinco géneros de dinoflagelados toxígenos, de los cuales cuatro estuvieron asociados a distintos grupos de ficotoxinas: Dinophysis a pectenotoxinas (PTX) y ácido okadaico (AO), Alexandrium a toxinas paralizantes de moluscos (TPM) y espirólidos (SPX), Protoceratium a yessotoxinas (YTX) y Azadinium a azaspirácidos (AZA). El género Dinophysis presentó dos especies asociadas mayormente con PTX y excepcionalmente con AO: D. acuminata y D. tripos. Esta última especie se encontró además asociada, por primera vez a nivel mundial, con la detección de PTX2-sa, un análogo relacionado comúnmente con modificaciones en la PTX-2 que ocurren como resultado de la digestión en moluscos. Por el contrario, la presencia de D. caudata y D. norvegica, esta última reconocida como causante de floraciones toxígenas en el Hemisferio Norte y hallada por primera vez en el suroeste Atlántico, no estuvo asociada con la detección de toxinas. El género Alexandrium se detectó con frecuencia y en una amplia área de distribución. Se lo encontró asociado a una gran variedad de perfiles de TPM entre los cuales sobresalieron, debido a su elevada toxicidad potencial, aquellos con altas proporciones de los análogos GTX1/4 detectados durante la campaña de primavera. Mediante la aplicación de técnicas moleculares y de microscopía se detectó por primera vez para el área de estudio a las especies A. minutum y A. ostenfeldii, las cuales estuvieron asociadas con TPM y SPX, respectivamente. Por otro lado, el análisis filogenético de células aisladas frente a Península Valdés confirmó la presencia del ribotipo I del complejo de especies A. tamarense, señalado previamente a partir del estudio de una cepa aislada frente a Mar del Plata. Si bien durante este estudio se observaron dos especies consideradas como potenciales productoras de YTX, Protoceratium reticulatum y Gonyaulax spinifera, los resultados obtenidos sugieren que el principal productor de YTX en el Mar Argentino es Protoceratium reticulatum. Por el contrario, Gonyaulax spinifera no presentó una asociación clara con YTX, y Lingulodinium polyedra, especie también considerada como productora de YTX a nivel mundial, no se observó en ninguna de las cuatro campañas realizadas. Las mayores concentraciones de YTX y de células de P. reticulatum se registraron en el Golfo San Jorge, lo cual representa un llamado de atención sobre el desarrollo de futuros eventos tóxicos en la zona. El género Azadinium alcanzó las máximas abundancias entre los dinoflagelados toxígenos observados en este estudio, con picos de 154.000 cél. L-1 en aguas del talud. Su presencia estuvo asociada a la detección de AZA-2 por primera vez para muestras de plancton de la región. Asimismo, su distribución geográfica, restringida en base a estudios previos a la zona norte del Mar Argentino (40 °S), se extendió hacia al sur hasta los 55°S. Estudios ultraestructurales permitieron identificar por primera vez para la zona a A. obesum y confirmar la presencia de otras tres especies recientemente citadas en el Mar Argentino (A. dexteroporum, A. poporum y A. luciferelloides), de las cuales dos (A. dexteroporum y A. poporum) son productoras de AZAs , así como detectar ejemplares cuya morfología no coincide con ninguna de las especies descriptas actualmente en la bibliografía. El presente estudio representa el primer análisis de las especies toxígenas de dinoflagelados presentes en el Mar Argentino mediante un enfoque integrado que incluye análisis microscópicos, moleculares y toxinológicos aplicados a muestras de campo. Los resultados obtenidos indican que la diversidad y ocurrencia de dinoflagelados toxígenos y sus respectivas toxinas presentes en el Mar Argentino es mayor a la considerada anteriormente y denota la necesidad de continuar y profundizar los estudios en la zona, especialmente mediante el establecimiento de cultivos celulares que permitan aumentar el conocimiento sobre su variabilidad morfológica, genética y toxinológica.

Dinoflagellates comprise the main group of microalgae associated with the production of Harmful Algal Blooms (HABs) in marine environments, mainly due to their ability to produce a large variety of toxic compounds that, when ascending in the food web, can cause severe damages in human and other vertebrate health. In the last decades, the frequency and intensity of HABs and their impacts on health and socioeconomic aspects have been apparently increased, leading to the development of a large number of studies related to this topic worldwide. In Argentina, the most important HABs episodes have been linked to the presence of different species of dinoflagellates, mainly from the genus Alexandrium, which caused severe damage to public health, death of several people, fish mortality and economic losses. However, new toxigenic species and different groups of toxins previously unknown have been recently detected in the region, from which the knowledge on the diversity and distribution is still limited. The main goal of this PhD thesis was to contribute to the knowledge on the diversity, abundance, spatio-temporal dynamics and toxin profile of the toxigenic dinoflagellates from the Argentine Sea. For this purpose, four oceanographic expeditions were carried out onboard different vessels between 2012 and 2016, comprising a total of 122 sampling stations. In each station, bottle and net samples were collected for phytoplankton and phycotoxins analysis, applying specific sampling protocols designed to relate cell densities and toxin concentrations, and thus estimate the toxin production per cell in natural environments. The phytoplankton samples were analyzed by optical and scanning electron microscopy. In addition, molecular analyzes of the genus Alexandrium were carried out to evaluate its specific diversity. Lipophilic toxin analyses were performed by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with tandem mass spectrometry (MS-MS), while hydrophilic toxins were analyzed by HPLC by post-column derivation and fluorescence detection. Dinoflagellates were observed in 95 % of the sampling stations, although in terms of abundance they only represented the dominant group of phytoplankton in eight stations. Their maximum cell densities (~ 2 x106 cells L-1 ) were observed in the northern slope region (40 °S) during a bloom of Prorocentrum cordatum. Other important dinoflagellates in terms of abundances were different species of Gyrodinium, Tripos and Protoperidinium, as well as small naked dinoflagellates. During the present study it was possible to detect the presence of five genera of toxigenic dinoflagellates, comprising 20 species, of which four were associated to different groups of phycotoxins: Dinophysis to pectenotoxins (PTX) and okadaic acid (OA), Alexandrium to paralytic shellfish toxins (PST) and spirolides (SPX), Protoceratium to yessotoxins (YTX) and Azadinium to azaspiracids (AZA). The genus Dinophysis presented two species, D. acuminata and D. tripos, mainly associated with PTX and exceptionally with AO. The latter species was also associated, for the first time worldwide, with the detection of PTX2-sa, an analogue commonly related to PTX-2 modifications that occur in mollusks as a result of the digestion process. In contrast, the presence of D. caudata and D. norvegica, the latter recognized as the cause of toxigenic blooms in the Northern Hemisphere and found for the first time in the Southwest Atlantic, was not associated with the detection of toxins. The genus Alexandrium was frequently detected, showing a wide distribution area and associated to a large variety of PST profiles; among them, profiles with high proportions of the GTX1/4 analogues detected during spring were particularly important due to the high potential toxicity of those analogues. Molecular and microscopy techniques applied in this study allowed to detect the presence of A. minutum and A. ostenfeldii for the first time in the study area, associated with PST and SPX, respectively. On the other hand, phylogenetic analysis of cells isolated from Valdés Peninsula confirmed the presence of the ribotype I of the A. tamarense species complex, previously identified from a strain isolated from Mar del Plata. During this study two species considered as potential producers of YTX were detected, Protoceratium reticulatum and Gonyaulax spinifera. However, the results suggest that the main producer of YTX in the Argentine Sea is Protoceratium reticulatum. In contrast, there was no clear association between Gonyaulax spinifera and YTX, and Lingulodinium polyedra, a species also considered worldwide as a producer of YTX, was not observed in any of the four sampling expeditions. The highest concentrations of YTX and P. reticulatum cells were recorded in the San Jorge Gulf, which is a call for attention on the development of future toxic events in the area. The genus Azadinium reached the maximum abundances among the toxigenic dinoflagellates observed in this study, with peaks of 154,000 cells L-1 detected from slope waters. Its presence was associated with the detection of AZA-2 in plankton samples for the first time in the study area. Likewise, its geographical distribution, previously restricted to the northern zone of the Argentine Sea (40 °S), is now extended southward to 55 °S. Ultrastructural studies allowed the identification of A. obesum for the first time in the Argentine Sea and confirmed the presence of other three recently mentioned species (A. dexteroporum, A. poporum and A. luciferelloides), of which two (A. dexteroporum and A. poporum) are confirmed as AZAs producers, and the presence of specimens with a different morphology that did not match with the currently described species. The present study represents the first attempt to analyze the toxigenic dinoflagellate species present in the Argentine Sea through an integrated approach that includes microscopic, molecular and toxinological analyzes applied to field samples. The results indicate that the diversity and occurrence of toxigenic dinoflagellates and their respective toxins in the Argentine Sea is greater than previously considered and also highlights the need to continue and improve the studies in the area, especially through the establishment of cultures that allow increasing the knowledge about its morphological, genetic and toxinological variability.