Participación de los genes citocromos p450 y del gen nadph-citocromo p450 reductasa en la resistencia a insecticidas piretroides en el vector de la enfermedad de Chagas Triatoma infestans
; Garcia, Beatriz Alicia ; Stroppa, Maria Mercedes Otros responsables
Fecha
Publicador:
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
Fecha de depósito:
7/11/2023
Fecha de creación:
13/12/2021
Clasificación temática
Palabras clave
Resumen
Los programas de control de la enfermedad de Chagas promueven la eliminación de las poblaciones del vector Triatoma infestans mediante la fumigación con insecticidas piretroides. Sin embargo, se han observado fallas en el control debido a la existencia de resistencia a los insecticidas. Incrementos en la expresión de genes de citocromos P450 son considerados responsables de aumentar el metabolismo de insecticidas y parece ser un fenómeno común en el desarrollo de resistencia. Las reacciones de mono-oxigenación de citocromos P450 requieren de electrones provistos por la NADPH citocromo P450 reductasa (CPR). Análisis de la expresión de genes P450 y del gen CPR en poblaciones resistentes y susceptibles a deltametrina, revelaron que genes P450 estarían involucrados en el desarrollo de resistencia a insecticidas piretroides en T. infestans. Con el objetivo de inferir si los citocromos P450 están involucrados en la resistencia a insecticidas, se propuso investigar el efecto del silenciamiento del gen CPR, utilizando ARN de interferencia (ARNi) en una población resistente a insecticidas piretroides de T. infestans. Los resultados evidenciaron una disminución significativa en la expresión del gen CPR de aproximadamente diez veces en el grupo de insectos que fueron inyectados con el ARNi del gen CPR con respecto a los niveles de expresión hallados en los grupos control. El silenciamiento del gen CPR en la población resistente a insecticidas piretroides mostró un incremento significativo en la susceptibilidad a deltametrina. Estos resultados refuerzan la hipótesis de que el proceso de desintoxicación metabólica mediado por citocromos P450 constituyen un factor fundamental en la resistencia a insecticidas piretroides observada en T. infestans.
Métodos
Procedencia de los Insectos: se utilizaron ninfas V de T. infestans (machos y hembras) de 1ra generación de laboratorio, provenientes de una colonia resistente a insecticidas piretroides originada a partir de individuos de la localidad de Pampa Argentina, Departamento de Gral. Güemes, provincia de Chaco (25°52’00.10’’S, 60°33’20.77’’O). La dosis letal 50% (DL50%) determinada para esta población fue >200ng/insecto y su grado de resistencia es >1000. Los insectos fueron mantenidos en condiciones de Temperatura: 28 ± 1 ºC, Humedad: 60-70 %, e Iluminación diaria: 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los distintos grupos experimentales se organizaron 12 días después de suministrarse una alimentación. Extracción de ARN y Síntesis de ADN copia (ADNc): La extracción de ARN total se realizó a partir de pooles de cuerpo graso de cinco ninfas V con el kit de purificación de ARN Master Pure (Epicentre) y la síntesis de ADNc se llevó a cabo a partir del ARN total utilizando la enzima transcriptasa reversa SuperScript IV (Invitrogen). Obtención de ARNi del gen CPR y su inserción por microinyección en ejemplares de T. infestans: Un fragmento del gen CPR de alrededor de 500 pares de bases se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando primers específicos y ADNc obtenido a partir de pooles de cuerpo graso de ninfas V de T. infestans. Ese producto de PCR fue secuenciado y se usó como ADN molde para la síntesis de ARNi utilizando el Sistema RiboMax T7 de Promega. El ARNi se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con isopropanol, para luego ser resuspendido en agua libre de nucleasas. Posteriormente, se inyectó un grupo de ejemplares (N=15) con 1µl de una solución del ARNi para el gen CPR (1µg/µl). Como control se utilizaron: un grupo no inyectado (N=15), otro inyectado con agua libre de ARNasas/DNAsas (N=15) y otro inyectado con 1µl de una solución de ARNi (1µg/µl) obtenido a partir del ADNc del gen -lactamasa (-Lac) (N=15). Dos días posterior a los tratamientos, los grupos de insectos se alimentaron y 6 días después se realizaron las disecciones. Se procedió a la extracción de ARN y la síntesis de ADNc según lo indicado previamente y se determinó la expresión del gen CPR según se detalla a continuación. Determinación de la expresión del gen CPR: la determinación de expresión del gen CPR se realizó mediante la técnica de PCR en Tiempo Real (qPCR) con sondas Taqman y primers específicos. Los niveles de expresión relativa del gen CPR se calcularon por el método 2-??CT (Livak y Schmittgen, 2001) utilizando como gen normalizador el de la ?-actina. Bioensayo: para investigar el efecto del silenciamiento del gen CPR en la población resistente a piretroides se inyecto un grupo de ejemplares con 1µl de una solución del ARNi para el gen CPR (N=15). Un grupo control no se inyectó (N=15) y el otro se inyectó con 1µl de una solución de ARNi (1µg/µl) del gen control ?-Lac (N=15). Dos días después de recibir las microinyección, los grupos de insectos tratados con ARNi para los genes CPR y ?-Lac y los insectos del grupo control no inyectado fueron alimentados. Seis días después de recibir esta alimentación se realizó la aplicación tópica en la región ventral del abdomen de los insectos de 1?l de una dosis elevada de solución acetónica del insecticida piretroide deltametrina. La dosis utilizada fue 250 veces mayor a la empleada para el cálculo de la DL50% en esta población resistente. El porcentaje de mortalidad en cada grupo se midió a las 72 hs posteriores a la aplicación tópica del insecticida. Análisis Estadístico: Cada experimento consistió en tres réplicas biológicas independientes y cada reacción se realizó por triplicado para contemplar la variación intra-experimental. El análisis estadístico se realizó mediante tests de ANOVA (One-way ANOVA) seguidos del Test de Bonferroni (de comparación múltiple) con el programa GraphPad Prism versión 9.00 para Windows. Para la significancia estadística se estableció un P<0.05.
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