Estructura de complejos dsRBD:pri-miRNA a través de restricciones obtenidas por etiquetas paramagnéticas y fluorescentes

Abstract

Los miARNs son moléculas de ARN pequeñas que están involucradas en la regulación de procesos fundamentales como el desarrollo, resistencia a estrés y respuestas a hormonas. Su biogénesis comienza con la transcripción de fragmentos más largos que son procesados en forma precisa por la maquinaria de procesamiento. Estos precursores son sumamente heterogéneos en plantas y el modo de reconocimiento de la maquinaria de procesamiento aún no ha sido resuelto. Por ello resulta interesante estudiar, desde una perspectiva estructural, la participación de las proteínas que forman parte del complejo. En particular, este trabajo de Tesis se centra en la proteína de procesamiento de miARN HYL1 de Arabidopsis thaliana. HYL1 posee dos dominios de unión a ARN doble hebra (dsRBD) unidos por un linker. A partir de una búsqueda bioinformática se analizó la conservación de tamaño y de secuencia del linker en proteínas que contienen dobles dsRBDs en distintas especies. Se pudo concluir que el largo del linker está muy conservado en especies plantas, en contraste con lo que se observa en especies del reino animal. Para comprender el rol de HYL1 dentro del complejo se planteó estudiar la distribución espacial que podrían presentar sus dominios de unión a ARN cuando están libres y/o unidos a ARN. En forma experimental se llevaron a cabo estudios que dan medidas de distancia en escala de nanómetros, en el rango de distancias que separan los dominios. Estas medidas se utilizaron luego en la selección de estructuras probables dentro de un conjunto de estructuras posibles generadas in silico. Las medidas fueron obtenidas a partir de técnicas de resonancia magnética sobre muestras que contienen la etiqueta LBT (Lanthanide Binding Tag). Se midió Pulsed Electron DOuble Resonance (PELDOR) entre las sondas para estimar la distancia entre dominios, tanto en forma libre como unida a ARN. La calidad de los datos obtenidos no permitió modelar con precisión la posible distribución de distancias. Por otro lado, se realizaron experimentos de Relajación Paramagnética Electrónica (PRE) midiendo la relajación producida en cada núcleo, la cual está relacionada con la distancia entre dichos núcleos y la sonda. Para la generación de estructuras posibles se trabajó con los programas Modeller y Rosetta, utilizando como molde estructuras cristalográficas disponibles en bases de datos. Con las medidas experimentales se seleccionó una subpoblación de estructuras que ilustra la dinámica entre los dominios cuando están libres utilizando código generado con el lenguaje Python. Las estructuras seleccionadas mostraron una notable cercanía entre sí, en donde los dos dominios se acercan por una de sus caras. Los experimentos sugieren que los dos dominios dsRBDs de HYL1 se mueven libremente, y que la longitud y posición del linker producen una asimetría en la libertad conformacional que estaría dada por restricciones geométricas simples.