Expresión recombinante del antígeno tE2 del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) en plantas de Nicotiana tabacum y estudio de su bioseguridad en ratones

Abstract

En el presente trabajo se expresaron el antígeno vacunal tE2 del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) y la proteína marcadora de fluorescencia EGFP en forma transitoria en hojas de Nicotiana tabacum, utilizando como vector Agrobacterium tumefaciens. Analizando la supervivencia microbiana y la persistencia del RNA/proteína de EGFP pudimos estimar un riesgo ambiental hasta 6 días después de la agroinfiltración. La cinética de tiempo y el análisis de imágenes para EGFP muestran el silenciamiento de la expresión de la proteína heteróloga 6 días después de la infiltración con la cepa de Agrobacterium recombinante en las hojas de tabaco tratadas. Los extractos foliares expresando tE2 fueron clarificados y mezclados con un adyuvante oleoso o acuosos. Estos candidatos a vacunas se administraron a ratones hembra Balb/c (inoculación primaria intramuscular seguida por tres dosis de refuerzo). No se observaron diferencias significativas entre los extractos no recombinantes (tratamiento control) o extractos foliares recombinantes en el análisis clínico y bioquímico. En todos los ratones inyectados, el adyuvante provocó las lesiones patológicas clásicas observadas en los procesos inflamatorios en el sitio de inoculación. Secciones histológicas de estas lesiones y de los órganos principales no mostraron lesiones adicionales.

Antigenic glycoprotein tE2 from bovine viral diarrhea virus (BVDV) and the fluorescence marker EGFP were transiently expressed in leaves of Nicotiana tabacum using Agrobacterium tumefaciens as vector. Analyzing the Agrobacterium and EGFP RNA/protein persistence allowed us to estimate an environmental exposure to recombinant material during 6 days after agroinfiltration. Time course analysis for the expression of EGFP shows silencing after 6 days post-infiltration with recombinant Agrobacterium strain in treated leaves. The leaf extracts expressing tE2 and EGFP were clarified at 6 days after agroinfiltration. The extracts were mixed with oil or aqueous adjuvants and injected to Balb/c mice in order to establish if the plant extracts are innocuous. Four doses were applied, followed by necropsy. No significant differences between non-recombinant extracts (control treatment) or recombinant leaf extracts in clinical and biochemical analysis were observed. In all mice injected, the adjuvant caused the classical pathological lesions observed in typical inflammatory processes at the site of inoculation. Histological sections of these lesions and major organs showed no further injury.