Clonación del gen de la proteína de fusión F del virus sincitial respiratorio humano en Escherichia coli

Abstract

El Virus Respiratorio Sincicial Humano (HRSV) es la principal causa de infección respiratoria aguda en niños pequeños. Su proteína de fusión F es responsable de la penetración del virus en células hospedadoras. F es antigénicamente conservada en los 2 subtipos virales (A y B) de HVRS e induce “in vivo” una respuesta de anticuerpos neutralizantes capaz de limitar la replicación viral. Es por ello un excelente candidato para el desarrollo de vacunas. Objetivo: Realizar la clonación del gen de proteína F (gen F) de HRSV en E. coli XL1 utilizando pGEM como vector de clonado. Materiales y métodos: La cepa LONG A de HVRS fue propagada en células Hep-2. Monocapas celulares fueron infectadas con el virus e incubadas a 37°C en incubador de CO2 al 5% durante 3-4d, hasta que la mayoría de las células mostraron un efecto citopático. Las células infectadas se cosecharon y congelaron a -70°C. De una alícuota de este cultivo se realizó la purificación de ARN con kit comercial. Luego, se realizó retrotranscripción del RNA viral y la amplificación de gen F por PCR. El amplicón fue clonado en pGEM Easy vector-T por ligación con T4 ligasa. La transformación de E. coli XL1 con el plásmido vector se hizo por electroporación. Resultados: Se obtuvieron clones positivos para gen F en pGEM=E. coli XL1-F. La identidad del fragmento clonado fue confirmada por PCR, análisis del perfil de restricción y secuenciación. Conclusiones: Se logró clonar exitosamente el gen F de HVRS, obteniéndose la cepa recombinante: E. coli XL1-F. A partir de ella se hará el clonado del gen en un vector de expresión para la producción de la proteína F recombinante en E. coli.