Contribución del genoma accesorio y de proteínas de membrana externa a la resistencia antimicrobiana en Acinetobacter baumannii

Abstract

Acinetobacter baumannii es una bacteria Gram-negativa de alta relevancia clínica por su creciente incidencia en infecciones nosocomiales y elevada morbimortalidad asociada, especialmente en individuos inmunocomprometidos o sometidos a procesos poli-traumáticos. En las últimas décadas las infecciones debidas a A. baumannii han aumentado rápidamente en frecuencia como consecuencia de la diseminación de un creciente número de cepas que exhiben resistencia a diferentes grupos de antimicrobianos, o multirresistencia (MR). Recientemente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha incluido a A. baumannii en la lista de microorganismos prioritarios, recomendando el avance en estrategias de investigación y desarrollo enfocadas al control y prevención de la diseminación tanto de los clones asociados a infecciones como de plataformas y elementos genéticos móviles (EGM) portadores de determinantes de resistencia. Como causas que contribuyen a la rápida evolución de MR en A. baumannii se proponen una combinación de factores intrínsecos que incluyen elevada plasticidad genómica, facilidad de adquirir material genético de bacterias del entorno, y elevada persistencia en el ambiente hospitalario. Es en este contexto que la emergencia en el ambiente nosocomial de cepas de A. baumannii con resistencia añadida a carbapenemas, última generación de β-lactámicos, de amplio espectro y elevada resistencia a la mayoría de β-lactamasas, constituye un grave problema global. Los mecanismos prevalentes de resistencia a carbapenemas en A. baumannii incluyen la producción de distintas serino-β-lactamasas tipo D u oxacilinasas (OXA) con actividad hidrolítica sobre carbapenemas (CHDL), con contribuciones menores de otros factores como reducciones en la permeabilidad de membrana externa (ME), bombas de eflujo, mutaciones en proteínas de unión a penicilina (PBP), y aún diferencias en genes metabólicos. Las principales CHDL descriptas a la fecha en cepas clínicas de A. baumannii pertenecen a los subgrupos OXA-23, OXA-24 y OXA-58, y sus genes son adquiridos mayoritariamente mediante transferencia horizontal de genes (THG). Aun así, los mecanismos que median la evolución y movilización de plataformas genéticas conteniendo los distintos genes blaOXA en la población clínica de A. baumannii son poco comprendidos en la actualidad. En estudios que comenzaron previamente en nuestro grupo de trabajo y continuaron durante el presente Trabajo de Tesis se caracterizaron cepas clínicas locales MR de A. baumannii clonal y epidemiológicamente relacionadas sin y con resistencia añadida a carbapenemas, incluyendo las cepas Ab244 sensible a carbapenemas (carbS ), y las Ab242 y Ab825 resistentes a las mismas (carbR ). Todas ellas pertenecen al complejo clonal 104 (CC104) prevalente en nuestra región. En este Trabajo de Tesis se caracterizó en detalle, a partir de la secuenciación de genomas completos, amplificación y clonado de fragmentos de ADN, como así también ensayos microbiológicos, a los plásmidos presentes en las cepas arriba mencionadas con especial énfasis en la dilucidación de los mecanismos de diseminación de determinantes de resistencias. Los estudios de pirosecuenciación, análisis in silico, y verificación de ensamblado de contigs mediante PCR y caminata genómica permitieron definir la estructura de los plásmidos presentes de las cepas clonales Ab244, Ab242 y Ab825, así como identificar sus módulos de replicación, estabilidad, adaptabilidad y transferencia. Esta caracterización permitió en principio detectar tres nuevos grupos de homología entre estos plásmidos basados en la comparación de las secuencias de replicasas codificadas en los mismos. Asimismo, permitió la identificación en las cepas carbR Ab242 y Ab825 de plásmidos de 25 kpb y 36 kbp (pAb242_25 y pAb825_36, respectivamente) portadores ambos de una estructura similar: i) un transposón defectuoso ISAba3 portador de un arreglo que consiste en el gen blaOXA-58 asociado a una ISAba825 corriente arriba, que resulta en la sobreproducción de la CHDL; 2) un transposón compuesto TnaphA6 que contiene el gen de una aminoglucósido acetiltransferasa. Esta estructura representa así un nuevo módulo de adaptabilidad que otorga a estos plásmidos la capacidad de conferir resistencia simultánea a carbapenemas y aminoglucósidos a su hospedador, a juzgar por ensayos de transformación sobre cepas sensibles de A. nosocomialis M2 y A. baylyi ADP1. Los estudios de secuenciación permitieron asimismo detectar en las cepas estudiadas otros plásmidos carentes de genes de resistencia, incluyendo uno de 9 kpb (pAb242_9) y otro de 12 kpb (pAb242_12) en Ab242, uno de 12 kpb idéntico a pAb242_12 en Ab825 (p Ab825_12), y uno de 7 kpb en la cepa carbS Ab244. Este último mostró elevada homología de secuencia con pAb242_9, excepto por la falta de una región de aproximadamente 2 kpb correspondiente al módulo de estabilidad. En pAb825_36 fue detectado asimismo un nuevo transposón compuesto constituido por dos IS26 bordeando al gen aac(3)-IIa que codifica para una aminoglucósido acetiltranferasa al que denominamos Tnaac(3)-IIa, el cual no se halla inserto en el módulo de adaptabilidad arriba descripto. Los estudios de pirosecuenciación permitieron revelar que pAb825_36 representa un producto de fusión entre un plásmido de 9 kpb idéntico a pAb242_9, y otro de 27 kbp (pAb825_27) formado por un plásmido de elevada homología a pAb242_25 excepto por la presencia de Tnaac(3)-IIa y la inversión del módulo de adaptabilidad arriba descripto. Estos resultados aportan evidencia sobre un importante flujo de plásmidos entre cepas clínicas de A. baumannii filogenética y epidemiológicamente relacionadas de nuestro entorno, sugiriendo que dichos EGM evolucionan en este ámbito mediante adquisición y pérdida de genes así como re-arreglos estructurales mediados por eventos de transposición y recombinación durante su tránsito por diferentes hospedadores bacterianos. Analizamos posibles eventos de recombinación involucrados en re-arreglos estructurales en los plásmidos de las cepas de A. baumannii en estudio, con el fin de evaluar el rol de estos procesos en la movilización entre EGM de estructuras portadoras de determinantes de resistencia antimicrobiana. Detectamos en todos los plásmidos de las cepas analizadas la presencia de varias secuencias cortas de 28 nucleótidos con homología con el sitio dif presente en el cromosoma bacteriano, el cual participa en procesos de recombinación específica de sitio para la resolución de dímeros formados durante la replicación del cromosoma. Estas secuencias se encuentran organizadas en dos secciones de 11 pb en los extremos, separadas por una región central, que actúan como sitios de reconocimiento de las tirosina-recombinasas del hospedador (XerC y XerD, respectivamente), y por tanto designados también sitios XerC/XerD. Numerosos plásmidos poseen un sitio equivalente y utilizan la maquinaria XerC/D del hospedador para resolver especies multiméricas formadas por procesos de recombinación homóloga las cuales, de persistir, llevan a la pérdida segregacional durante la replicación del hospedador (o “catástrofe del dímero”). Una búsqueda exhaustiva de los sitios XerC/XerD realizada en los plásmidos de las cepas estudiadas detectó un total de 17 sitios diferentes en los 3 plásmidos de Ab242, 8 de los cuales están en las proximidades o dentro del módulo de adaptabilidad presente en pAb242_25 (o en pAb825_36), que contiene los genes de resistencia blaOXA-58 y aphA6. Esta elevada cantidad de sitios XerC/XerD por plásmido sugiere fuertemente que los mismos cumplen otros roles además de participar en la resolución de formas multiméricas de los plásmidos individuales. Así, mediante experimentos de transformación con plásmidos totales de Ab242 sobre cepas sensibles de A. nosocomialis M2 carentes de plásmidos y selección por imipenem (IPM) encontramos que la especie transformante con capacidad de replicar y conferir resistencia a ese nuevo hospedador consistió en un co-integrado formado por la fusión de los plásmidos pAb242_25 y pAb242_12 (i.e., pAb242_36) a través de un evento intermolecular de recombinación sitio-específica mediado por un par particular de sitios XerC/XerD. Además, encontramos que este co-integrado se resuelve en el nuevo hospedador también mediante recombinación sitio-específica intramolecular utilizando el nuevo par de sitios XerC/XerD formado durante la fusión. Ello sugiere una dinámica novedosa para los plásmidos de Ab242 representada por un equilibrio activo entre estructuras resultantes de procesos de recombinación sitioespecífica inter- e intramolecular mediada por pares de sitios XerC/XerD. Ensayos de hibridización, PCR y caminata genómica permitieron claramente confirmar en los plásmidos totales de Ab242 la presencia del co-integrado formado por la fusión de pAb242_25 y pAb242_12, indicando efectivamente la presencia de dicho equilibrio, si bien, desplazado hacia la resolución de los co-integrados. Los resultados anteriores nos llevaron a analizar en detalle la estructura del plásmido pAb825_36 identificado en Ab825 y la posibilidad de que el mismo derive de eventos de recombinación sitio-específica mediados por sitios XerC/D. Análisis de comparación de secuencias, sumados a ensayos de PCR y caminata genómica nos permitieron identificar los diferentes eventos de recombinación sitio-específica intra- e intermoleculares que generaron la estructura localizada en Ab825. Uno de ellos fue mediado por un par de sitios XerC/XerD localizados en los bordes del módulo de adaptabilidad que contiene los genes blaOXA-58 y aphA6 y que ocurrió en un ancestro de pAb827_27, el cual condujo a la inversión de dicho módulo en este plásmido respecto a la misma estructura localizada en pAb242_25. El segundo consistió en un evento intermolecular de fusión también mediado por un par de sitios XerC/D activos localizados uno en pAb827_27 y otro en pAb825_9, el cual condujo finalmente a la estructura de pAb825_36 localizada en Ab825. Aun así, numerosos ensayos, incluyendo hibridación, PCR y caminata genómica sobre plásmidos totales de Ab825, indicaron que pAb825_36 se encuentra mayoritariamente resuelto en esta cepa, indicando asimismo la existencia de equilibrios activos de fusión y resolución de plásmidos mediados por recombinación sitio-especifica entre pares activos de sitios XerC/D. De hecho, estudios de transformación sobre cepas sensibles de A. nosocomialis M2 con plásmidos totales de Ab825 indicaron que la especie transformante con capacidad de replicar y conferir resistencia a imipenem estaba formada por un co-integrado entre pAb825_27 y pAb825_12, derivado de la recombinación sitio-específica intermolecular mediada por otro par de sitios XerC/XerD, resuelto asimismo rápidamente en este nuevo hospedador. En este trabajo, el análisis comparativo de los genomas completos de las cepas clínicas locales MR contribuyó a una mayor comprensión de los EGM involucrados en la adquisición de resistencia a carbapenemas y de los potenciales mecanismos de su diseminación, revelando a la recombinación sitio-específica mediada por pares de sitios XerC/XerD como mecanismo que promueve una elevada plasticidad genómica. El hallazgo reportado aquí de que los plásmidos de A. baumannii contienen un número elevado de sitios XerC/XerD capaces de conformar pares recombinacionalmente activos que median fusiones, resoluciones, e inversiones tiene un impacto significativo en la dinámica de estos elementos móviles y la diseminación de las estructuras de resistencia que éstos llevan. En principio, ciertamente abre la posibilidad de formación de cointegrados entre plásmidos temporalmente coexistentes en los que uno de los constituyentes está dotado de capacidades de auto-transferibilidad, lo que permite la diseminación de otros plásmidos como “cargo” mediante el proceso de conducción. La resolución rápida de los co-integrados una vez en la nueva célula hospedadora mediada por pares de sitios XerC/XerD por recombinación sitio-específica intramolecular demostrada en este Trabajo de Tesis, ciertamente agrega soporte a esta posibilidad. Además, la generación de co-integrados por fusión entre diferentes plásmidos así como los eventos de inversión aumentan las posibilidades de reordenamientos intramoleculares adicionales tales como resoluciones, eliminaciones y/o inversiones dependiendo de las ubicaciones y orientaciones de los nuevos pares disponibles de sitios XerC/XerD. Plásmidos de A. baumannii formados por más de un replicón se han reportado anteriormente, lo que sugiere que la fusión del replicón puede ser relativamente frecuente en esta especie y proporcionarían ventajas selectivas para la diseminación del plásmido y/o de los determinantes de resistencia que estos portan. De hecho, la fusión de replicones puede expandir el rango de hospedadores al proporcionar funciones de establecimiento y/o estabilidad que faciliten su permanencia exitosa en un nuevo hospedador independientemente del mecanismo de diseminación del co-integrado (conjugación, transformación, transducción, o THG no canónica). En este contexto, hemos observado que el co-integrado entre pAb242_25 y pAb242_12, y no el plásmido pAb242_25 solo, o el co-integrado formado entre pAb825_27 y pAb825_12, pero no entre pAb825_27 y pAb825_9, fueron las especies con capacidad de establecerse con éxito en A. nosocomialis cuando este organismo fue usado como hospedador para la transformación. Es importante considerar que, aunque las posibilidades de rearreglos de plásmidos mediadas por recombinación específica de sitio utilizando los sitios XerC/XerD presentes en los plásmidos reportados pueden ser enormes, todo el proceso se encuentra “filtrado” por la selección ambiental y solo algunas estructuras exitosas tomarán eventualmente el control para continuar su diseminación y evolución en la población bacteriana. Las medidas de control de diseminación de cepas MR de A. baumannii y de sus determinantes de resistencia deben considerar ciertamente el efecto de la fuerte presión de selección provocada por el tratamiento con antimicrobianos como las carbapenemas sobre la rápida selección de dichas estructuras, y la necesidad imperiosa de un uso racional de estas últimas armas contra infecciones por bacterias MR.