Producción de fermentos: optimización, validación y caracterización de un medio de cultivo formulado a base de permeado de suero de queso

Abstract

En el presente trabajo se optimizó y validó la producción de biomasa de Lacticaseibacillus rhamnosus 73 (L73) en un medio de cultivo formulado a partir de permeado de suero de quesería.Además, se evaluó la producción de biomasa de otras cepas de lactobacilos en el medio de cultivooptimizado. Finalmente, se valoró la influencia del control de pH durante el crecimiento de L73 enla producción de biomasa, actividad enzimática, consumo/producción de ácidos orgánicos, ycompuestos volátiles. Para la optimización de la producción de biomasa se aplicó un diseño centralcompuesto, constituido por 21 puntos experimentales. Los cuatro factores estudiados fueron:permeado de suero, extracto de levadura, MnSO4 y MgSO4. La cepa L73 fue inoculada en cadamedio al 2% v/v e incubada (37ºC, 24h) para luego realizar determinaciones de recuentosmicrobiológicos en placa (MRS, 37ºC, 48h) y densidad óptica (DO600nm) como medida de biomasa. Los resultados experimentales se procesaron en el programa Design-Expert® 7.0.0 para asignar modelos matemáticos de ajuste. Mediante el método de superficie de respuesta y la función deseabilidad se hallaron los niveles necesarios de los factores para lograr la mayor biomasa posible.La validación del medio optimizado se realizó por triplicado y además se incluyeron otras 10 cepasde lactobacilos de interés industrial. El impacto del control de pH durante el desarrollo de biomasade L73 en el medio optimizado se evaluó por triplicado realizando fermentaciones batch de 1L a pHlibre y a pH controlado utilizando el equipo Sartorius Biostat A plus. Para ello, el medio de cultivooptimizado se llevó a pH=6,5 y se inoculó la cepa L73 al 2% v/v. El desarrollo se llevó a cabo a 37°Cy a pH libre o controlado a pH=6,5 utilizando NaOH 2,3N estéril. Durante el proceso se tomaronmuestras a distintos tiempos: t0 (0hs), t1(5hs), t2(12hs), t3(24hs), en las que se analizaron la DO600nm y los recuentos microbiológicos en placa (37°C, 24hs). A tiempo final, se determinaron los niveles de carbohidratos y ácidos orgánicos por HPLC y compuestos volátiles por SPME-GC-FID.Finalmente, se determinaron enzimas peptidasas en extractos libres de células obtenidos pordisrupción celular.El modelo seleccionado para cada respuesta reveló un ajuste significativo (p<0,05) y parámetros defalta de ajuste no significativos. Los niveles máximos de biomasa se lograron con los niveles máselevados de permeado de suero y extracto de levadura. La incorporación de MnSO4 y MgSO4 notuvo un impacto significativo. La función deseabilidad permitió obtener la concentración depermeado de suero (12,876 g/100 mL) y extracto de levadura (0,3529 g/100 mL) necesarias paralograr la máxima producción de biomasa de L73. Durante la validación se obtuvieron elevadosniveles de L73 (promedio=2,36x109 ufc/mL) confirmando así la respuesta teórica. Estos resultadosfueron similares a los obtenidos en el medio comercial MRS. El recuento para 8 de las otras 10cepas de lactobacilos estudiadas, también fue alto (entre 4,47x108 ? 1,70 x109 ufc/mL). Por otrolado, mayores niveles de biomasa de la cepa L73 se obtuvieron a pH controlado (5,28x109 ufc/mL)en relación al pH libre (2,28x109 ufc/mL). El pH de crecimiento no generó cambios significativos enla producción de peptidasas; observándose niveles altos para los cuatro sustratos evaluados. Laactividad metabólica fue diferente según el pH del medio: a pH controlado la cepa produjo mayoresniveles de ácido láctico, acético y pirúvico y una mayor metabolización de ácido cítrico. Además,metabolizó el ácido hipúrico y produjo ácido benzoico. El perfil de compuestos volátiles de losmedios a pH libre y controlados fueron significativamente diferentes al final de la incubación.En conclusión, el nivel de biomasa obtenido para L73 en el medio de cultivo optimizado responde alos requeridos para su industrialización. El desarrollo de L73 a pH controlado mejorósignificativamente la producción de biomasa y la actividad metabólica respecto al pH libre.