Rol de las metaloproteinasas hemorrágicas en las alteraciones hemostáticas inducidas por el veneno de Bothrops alternatus

Abstract

Muchas especies de animales, entre ellos las serpientes, han desarrollado la capacidad de inyectar o liberar secreciones venenosas con el propósito de controlar, inmovilizar y digerir sus presas. Sin embargo su inoculación por motivos de defensa, es la que ocasiona el accidente ofídico, tanto en humanos como en animales, el cual se presenta como un cuadro fisiopatológico que puede ser fatal. Las especies de serpientes de mayor importancia médica responsables de los accidentes en humanos en el Nordeste Argentino, pertenecen a la familia Viperidae, siendo las intoxicaciones por las especies de Bothrops alternatus y Bothrops diporus las más frecuentes (98%).El envenenamiento por estas serpientes se caracteriza por manifestaciones locales, que se presentan minutos después de la inyección del veneno, tales como dolor intenso, edema y hemorragia local. Estos signos son seguidos por dermo- y mionecrosis, como así también formación de ampollas que rodean al sitio de mordedura. En casos graves provocan alteraciones sistémicas, caracterizadas por hemorragia en órganos y vísceras, coagulación intravascular diseminada (CID) seguida de desfibrinogenación y alteraciones hemodinámicas que pueden llevar a shock cardiovascular, insuficiencia renal aguda (IRA) e incluso la muerte. Entre las manifestaciones, la hemorragia es reconocida como un episodio temprano, frecuente y clave en la clínica del envenenamiento, que conjuntamente a las alteraciones hemostáticas definen la gravedad de la intoxicación. La hemorragia es el resultado de la alteración en la interacción entre plaquetas, factores de la coagulación y la pared vascular, donde el endotelio cumple un papel fundamental. El fenómeno fisiológico que detiene el sangrado se conoce como hemostasia. La respuesta hemostática ha sido clasificada en tres procesos: la hemostasia primaria donde participan fundamentalmente el endotelio y las plaquetas, la hemostasia secundaria que comprende la activación del sistema de coagulación y la fibrinólisis que involucra la degradación de la malla de fibrina. Dado el grado de afectación que inducen los venenos botrópicos en la hemostasia ha cobrado importancia el conocimiento acerca de la manera en que las toxinas afectan el adecuado funcionamiento de la circulación sanguínea y el sistema vascular. De todos los componentes, las metaloproteinasas y las serinoproteinasas de veneno de serpientes (SVMPs y SVSPs, respectivamente) dada su capacidad de clivar el enlace peptídico son las principales involucradas en las alteraciones hemostáticas. Bothrops alternatus conocida como yarará grande o víbora de la cruz es la especie de mayor distribución y abundancia en el NEA y su veneno está constituido en un 43% por enzimas de la familia de las SVMPs, que tienen un rol clave en el envenenamiento.Dado el cuadro de intoxicación inducido por el veneno de B. alternatus y la abundancia de las SVMPs en ésta secreción, fue de interés dilucidar su rol en las alteraciones hemostáticas que desencadena este veneno, como así también la acción sinérgica con otras toxinas involucradas en estas alteraciones. Para discernir la participación de las SVMPs se usaron como herramientas: inhibidores de metalo- (EDTA-Na2) y de serinoproteinasas (PMSF), baltergina (una SVMP P-III hemorrágica), anticuerpos anti-baltergina y baltergina-DC (fragmento estable de autoproteólisis de baltergina). En primera instancia, se debió aislar y purificar del veneno de B. alternatus la enzima baltergina. La hemorragina purificada se sometió a autoproteólisis previo ajuste de las condiciones óptimas de pH, temperatura y tiempo, para posteriormente llevar a cabo el aislamiento de baltergina-DC. Por otro lado, baltergina fue utilizada como inmunógeno para la producción de inmunoglobulinas G (IgGs) toxino-específico, que junto con EDTA-Na2, fueron empleados para estudios de neutralización del veneno entero. La fracción IgG fue purificada del suero anti-baltergina por cromatografía de afinidad y estos anticuerpos fueron capaces de neutralizar completamente la actividad hemorrágica y proteolítica (azocaseína) del veneno en una relación 1/20 (veneno/IgGs anti-baltergina). Como estudios complementarios a los objetivos inicialmente propuestos en esta tesis, fue posible profundizar en la estructura de las toxinas. Mediante estudios de 2D-PAGE de baltergina se observó la presencia de 9 isoformas acídicas (rango de pI= 4,8 - 5,7). Del análisis de espectrometría de masas se logró identificar un 68% de identidad con la secuencia de botropasina, una SVMP P-III aislada del veneno de B. jararaca. Se determinó la secuencia parcial de baltergina-DC, obteniéndose 36 aminoácidos del extremo amino-terminal.Para abordar el efecto de las SVMPs en la hemostasia primaria mediante un ensayo de agregación plaquetaria se demostró que baltergina-DC fue capaz de inhibir la agregación de manera dosis dependiente, observándose una inhibición del 43,65% con la dosis más alta ensayada (50 µg/ml), utilizando ADP como agente agregante. A la vez, se determinó el tiempo de sangría (TS), para ello grupos de animales fueron inoculados con PBS, veneno (20 µg) y veneno pre-incubado con IgG anti-baltergina (relación 1/30). A las dos horas, los resultados mostraron que el TS de animales inoculados con veneno se prolongó tres veces respecto al control, y en los animales tratados con veneno pre-incubado con anticuerpos toxino-específicos la sangre no coaguló al tiempo y dosis ensayados. Se realizó el recuento de plaquetas en el plasma de los diferentes grupos de ratones y se observó una marcada trombocitopenia en los animales tratados con veneno y veneno pre-incubado con IgG anti-baltergina. A partir de estos estudios se comprobó que las SVMPs del veneno de B. alternatus intervienen en la alteración que induce esta secreción en la hemostasia primaria, específicamente al inhibir la agregación plaquetaria, donde la región símil desintegrina ha de tener un rol clave.Para evaluar el efecto de las metaloproteinasas sobre la hemostasia secundaria se realizaron ensayos tanto in vitro como in vivo. El tiempo de coagulación (TC) fue registrado enfrentando plasma citratado a una solución de veneno, como así también a veneno pre-incubado con EDTA-Na2, con PMSF y veneno pre-incubado con IgG anti-baltergina. Los resultados mostraron que el veneno-EDTA-Na2 y el veneno-IgG anti baltergina alargaron 3,5 y 3,1 veces, respectivamente, el TC respecto al control de veneno, mientras que para el veneno-PMSF se registró un TC 7,7 veces más prolongado respecto al control. Asimismo se registró el TC sobre fibrinógeno utilizando las mismas muestras y no se observó cambios en el registro del TC en el control de veneno y el veneno inhibido por EDTA-Na2 e IgG anti-baltergina, sin embargo no se observó la formación de malla de fibrina cuando se expuso el fibrinógeno al veneno-PMSF. Se determinó la concentración de fibrinógeno en plasma citratado de grupos de ratones inoculados por vía i.v. con PBS, veneno (20 y 40 µg) y veneno-IgG anti-baltergina (relación 1/30). Tanto los ratones inoculados con la dosis más alta de veneno como aquellos inoculados con veneno-IgG anti-baltergina, presentaron un plasma incoagulable lo cual indicó depleción de fibrinógeno circulante.Se comprobó así que las SVMPs afectan la hemostasia secundaria, bajo una acción conjunta con las serinoproteinasas. El alargamiento en el TC observado sobre plasma, y ?no sobre fibrinógeno?, por parte del veneno bloqueado tanto con EDTA-Na2 como con IgG anti-baltergina, dejó en evidencia que las SVMPs tienen un rol pro-coagulante. La incapacidad de formar la malla de fibrina por parte del veneno bloqueado con PMSF reflejó el rol exclusivo de las SVSPs con actividad thrombin like. Los ensayos in vivo refuerzan lo observado in vitro. Los anticuerpos no fueron capaces de neutralizar la actividad coagulante del veneno, siendo entonces las SVSPs los principales componentes responsables de provocar depleción de fibrinógeno por consumo. En conclusión, el presente trabajo permite reconocer a las SVMPs como toxinas claves en las alteraciones hemostáticas que pueden conducir a la muerte en el envenenamiento por B. alternatus. Así su responsabilidad directa sobre la hemorragia, sobre la inhibición de la agregación plaquetaria y su contribución en la depleción del fibrinógeno circulante, las vuelve enzimas con una remarcada participación en las alteraciones en la hemostasia inducidas por este veneno botrópico. Los resultados aquí descriptos, conjuntamente a evidencias reunidas de estudios previos, demuestran que los anticuerpos anti-baltergina serían efectivos neutralizando la hemorragia (tanto local como sistémica), proteólisis de componentes de la matriz extracelular, formación de trombo plaquetario y en general todos los efectos inducidos por las SVMPs. Sin embargo si se utilizaran potencialmente como terapia, la víctima del accidente ofídico tratada con un anti-suero anti-baltergina se encontraría en un estado anticoagulado transitorio pero sin extravasación de sangre, evitándose con ello la principal causa de muerte por parte de este veneno.Finalmente esta tesis aporta información que podría ser relevante para el diseño de inmunobiológicos más específicos, de baja carga proteica, tendientes a optimizar la actual seroterapia antiofídica.