Diversidad fenotípica y genética de lactobacilos heterofermentantes aislados de muestras provenientes de industrias lácteas

Abstract

Las bacterias lácticas (BAL) se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza siendo habitual su presencia en leche y productos lácteos, entre otros. Dentro de este grupo, determinadas especies del género Lactobacillus poseen gran importancia ya que ciertas cepas son parte constituyente fundamental de cultivos iniciadores para elaboración de una variedad de productos lácteos fermentados, o son adicionadas a los mismos por sus atributos probióticos. Por estas razones, muchas cepas poseen un elevado valor industrial y comercial. El género, el más amplio y heterogéneo dentro de las BAL, se subdivide de acuerdo a su metabolismo en: homofermentantes y heterofermentantes (facultativos u obligados). Los lactobacilos heterofermentantes obligados (LHeo) producen CO2 a partir de hexosas y pueden estar presentes en leche cruda y ambiente lácteo, formando parte de las NSLAB (non starter lactic acid bacteria, por su sigla en inglés). Su presencia puede influir positivamente, por ejemplo en el flavor de los quesos, aunque si se encuentran en elevada concentración pueden alterar la calidad del producto. Estudios previos realizados en nuestro Instituto, fruto de un muestreo (entre 1999 y 2003) de quesos blandos, semiduros y leches pasteurizadas destinadas a su elaboración enviados al laboratorio por industrias lácteas de nuestro país, detectaron la presencia de Lactobacillus fermentum, como responsable del defecto gasógeno en los quesos semiduros. La aplicación en alimentos de lactobacilos aislados a partir de productos lácteos tradicionales naturalmente fermentados muestra una larga tradición de uso seguro (status GRAS, acrónimo de Generally recognized as safe) y existe un interés creciente en la utilización comercial de estas cepas, potencialmente poseedoras de atributos probióticos. Todo esto torna importante el estudio del grupo de LHeo autóctonos y adventicios que podría resultar una fuente interesante de cepas para ser explotadas por la industria láctea regional. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la diversidad fenotípica y genética que presenta un grupo de LHeo aislados de muestras enviadas por diversas industrias lácteas en Argentina, entre 1999 y 2012; así como también, reducir el número de aislamientos para cumplimentar posteriormente su identificación genética. Las cepas se relevaron del cepario perteneciente al Instituto de Lactología Industrial (INLAIN) y se reactivaron en caldo MRS con campanitas de Dürham a 34°C para corroborar la producción de gas. Luego, continuando con su caracterización fenotípica, se sometieron a la prueba de catalasa con peróxido de hidrógeno, se observó morfología y agrupación celular mediante microscopio óptico de contraste y morfología de colonia. En paralelo se comprobó la pureza de los aislamientos mediante repeticiones sucesivas de estrías en agar MRS y crecimiento en caldo con campanita. A continuación y a fin de caracterizarlos genéticamente en forma preliminar, se extrajo el ADN total de cada cepa pura utilizando un kit de extracción comercial. Para el análisis de diversidad se realizó RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction, por su sigla en inglés), utilizando alternativamente los primers 1254 y M13 y se procesaron los resultados obtenidos mediante el uso del programa BioNumerics. Un grupo de 42 aislamientos fue relevado a partir del Cepario en el período de tiempo en estudio. La caracterización fenotípica de los mismos demostró que en su totalidad produjeron gas entre las 20 y 48 h de incubación y que un 81% (34) de los mismos son catalasa negativos. Respecto a la morfología de sus colonias se observó como cualidad relevante que un 40% (17) de los aislamientos presentaban heterogeneidad morfológica en sus colonias y que esta característica se mantenía a lo largo de la purificación. En base a los dendrogramas elaborados para comparar los resultados obtenidos mediante RAPD-PCR con los primers M13 y 1254, a un nivel del 46% de similitud se pudieron diferenciar cuatro clusters, que podrían sugerir en forma muy preliminar la agrupación de los aislamientos en cuatro especies distintas. A su vez, para un grado de similitud del 80%, criterio que surge de considerar la sensibilidad de la metodología para discriminar entre cepas diferentes, se logró reducir a 14 el número de aislamientos que se someterán en el futuro a identificación genética por amplificación, secuenciación y comparación del gen que codifica para el ARNr 16S. Un grupo de los aislamientos que mostraron heterogeneidad en la morfología de sus colonias se sometió a estudios por RAPD-PCR. Para cada aislamiento se tomó como clones divergentes a los que poseían morfologías de colonia distintas para comprobar si la heterogeneidad observada se correlacionaba con la diversidad genética estudiada. Esto último no se verificó, ya que la similitud genética entre clones hermanos superó el 93%. Por otra parte, considerando que un 62% (26) de los aislamientos relevados provinieron de una misma planta láctea, interesó estudiar si el origen, las fechas de los aislamientos y las muestras de las que se aislaron se relacionaban con la similitud genética, para lo cual se direccionó el estudio a esta planta. La realización del dendrograma sólo para los aislamientos de esta planta arrojaron ocho patrones distintos al nivel del 80% de similitud, y dentro de estos clusters se comprobó que en su gran mayoría aquellos aislamientos que eran más parecidos genéticamente se habían realizado en fechas cercanas entre ellas y/o a partir del mismo tipo de muestra, indicando que podría tratarse de aislamientos múltiples de la misma cepa. El presente estudio permitió conocer características particulares de los LHeo autóctonos relevados como ser, la amplia diversidad genética del grupo y la elevada frecuencia de heterogeneidad fenotípica asociada a una cepa. Asimismo, mostró la permanente presencia a lo largo del tiempo de cepas de LHeo en una de las plantas lácteas. Por último, redujo considerablemente el número de cepas que será necesario identificar genéticamente sin perder la diversidad presente, para proseguir profundizando el estudio de este grupo.