Actividades farmacológicas de la fosfolipasa A2 Ba SpII RP4 del veneno de Bothrops alternatus

Abstract

El objetivo del trabajo fue evaluar actividades farmacológicas (citotóxica, bactericida, agregante plaquetaria) y factores que afectan la actividad/ estabilidad de la fosfolipasa A2 (PLA2 ) aislada del veneno de Bothrops alternatus. Se utilizaron mioblastos/miotúbulos murinos (C2C12) y cepas bacterianas de Staphylococcus aureus (cepa ATCC 25923) y Escherichia coli (cepa ATCC 25922) para valorar respectivamente su acción miotóxica (in vitro) y bactericida, como así también líneas celulares epiteliales mamarias normales (NMuMG) y tumorales (LM3) para detectar su posible aplicación en terapia oncológica. Con el fin de evaluar la acción inhibitoria de la PLA2 aislada sobre la agregación plaquetaria se empleó plasma rico en plaquetas y trombina como inductor fisiológico. Por último, se registraron los cambios en la actividad y estabilidad de la PLA2 a diferentes temperaturas (4-90ºC) mediante ensayo cinético, en tanto que, por hemólisis radial indirecta se hizo lo mismo para evaluar efecto del pH (2,5-10). La PLA2 mostró una acción inhibitoria sobre la agregación plaquetaria dosis-dependiente. Presentó una alta estabilidad estructural al ser sometida a condiciones extremas de pH y temperatura durante varias horas, conservando la actividad catalítica prácticamente invariable. En cambio, cuando PLA2 fue evaluada sobre las diferentes líneas celulares, no produjo citotoxicidad (aún a dosis elevadas) ni efecto bactericida sobre las cepas utilizadas. Estos hallazgos amplían la caracterización de la enzima, una de las más abundantes del paquete proteico del veneno total de B. alternatus del nordeste argentino. A la vez, la inocuidad y estabilidad detectadas, permiten proponer a esta enzima como un inmunógeno alternativo en la producción de sueros antiofídicos.

The aim of this work was to evaluate the pharmacological activities (citotoxicity, bactericidal, platelet aggregation) and the changes in the activity/stability of the isolated phospholipase A2 (PLA2 ) from Bothrops alternatus venom. In order to elucidate myotoxic and bactericidal activities, murine mioblast /miotubules (C2C12) and strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25922) were used, respectively. Also, normal mammary epithelial cell culture (NMuMG) and tumoral type (LM3) were tested for a possible role in oncological therapy. With the purpose of studying the inhibitory effect of the PLA2 on platelet aggregation, washed human platelet and thrombin as physiological inductor, were used. Finally, changes in the activity and stability of the isolated PLA2 at different temperatures (4-90ºC) by kinetic assays were recorded; while the enzyme was subjected to radial indirect hemolysis to evaluate the effect of different pH (2.5-10). The PLA2 presented dose-dependent inhibitory effect on thrombin-induced platelet aggregation. Also, it showed high structural stability when exposed to extreme conditions of temperature and pH during several hours, and catalytic activity remained almost unchanged. Nevertheless, this enzyme tested on different cells cultures did not induce cytotoxic (even at high doses) or bactericidal activities. These findings have a scientific value for toxicology since they expand the knowledge of the characterization (biological, biochemical and structural aspects) of one of the most abundant enzyme (PLA2 Ba SpII RP4) from the protein package of B. alternatus snake venom from the northeast of Argentina. Likewise, the confirmed safety and stability of this PLA2 strongly suggest that it could be proposed as an alternative immunogen for the antiserum production against Bothrops snake venom.