Estudio del efecto citotóxico y hemolítico de las surfactinas producidas por bacterias del grupo Bacillus subtilis
; Jofré, Edgardo ; Ibarra, Luis Exequiel Otros responsables
Fecha
Publicador:
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
Fecha de depósito:
26/05/2026
Fecha de creación:
2024-2025
Clasificación temática
Palabras clave
Resumen
Las surfactinas son una familia de lipopéptidos cíclicos (LPCs) que, debido a su naturaleza anfifílica, poseen la capacidad de insertarse en membranas biológicas y alterar su permeabilidad. En este contexto, estudiar sus efectos biológicos resulta de interés para comprender su perfil de seguridad y, al mismo tiempo, explorar su potencial aplicación biotecnológica y terapéutica, particularmente por su interacción con eritrocitos y su acción sobre células tumorales. Con este propósito, las surfactinas producidas por Bacillus velezensis MEP218, Bacillus amyloliquefaciens ARP23, Bacillus velezensis A6 y Bacillus subtilis A7, fueron evaluadas mediante ensayos de hemólisis y citotoxicidad en las líneas celulares MRC-5 (fibroblastos pulmonares fetales humanos normales) y U87 MG (glioblastoma humano derivado de tumor cerebral).
Métodos
Actividad hemolítica de surfactinas Se obtuvo sangre de ratones BALB/c (Mus musculus) y se utilizó como anticoagulante Na-EDTA al 10 %. Se descartó el plasma mediante centrifugación (1300 rpm, 5 min) y los eritrocitos se lavaron 3 veces con PBS (1300 rpm, 5 min). Luego de los lavados, se preparó una suspensión de glóbulos rojos 1:10 en PBS y se sembraron 100 µL por pocillo en una placa de 96 pocillos, fondo en “U”. Los eritrocitos fueron centrifugados en una centrífuga para placas multi pocillos (1000 rpm, 10 min) y, posteriormente, se eliminó el sobrenadante. A los eritrocitos que precipitaron hacia el fondo del pocillo, se les agregaron 150 µL de los tratamientos 0,5; 0,25; 0,1; 0,05 y 0,01 mg/mL se surfactinas, con un mínimo de 3 réplicas técnicas por tratamiento. Se utilizaron Tritón X-100 al 1 % como control positivo, PBS como control negativo y MeOH como control de solvente de las surfactinas. Los tratamientos se incubaron a 37 °C durante 1 h, y después de este tiempo, los eritrocitos se centrifugaron nuevamente (1000 rpm, 10 min). Finalmente, los sobrenadantes se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo plano y se determinó la hemoglobina liberada por absorbancia a 540 nm. Estos valores de absorbancia obtenidos se utilizaron para obtener el porcentaje de hemólisis, considerando al control positivo como 100 % de hemólisis. Citotoxicidad en MRC-5 y U87 MG Las líneas celulares MRC-5 y U87 MG se cultivaron en medio DMEM suplementado con antibióticos y 10 % de SFB a 37 °C y 5 % de CO₂ hasta alcanzar 80–90 % de confluencia. Luego, se eliminó el medio de crecimiento, se lavaron las células con PBS y se les agregó 1 mL de tripsina (se incubó durante 5 min a 37°C, 5% CO2). Para inactivar la tripsina, se agregó 1 mL de DMEM completo y las células se transfirieron a un tubo, a partir del cual se tomó una alícuota para realizar el recuento de estas. Las células se sembraron en placa de 96 pocillos fondo plano, a una concentración de 10.000 células por pocillo, con un volumen final de 100 µL. Después de 24 h, se retiró el medio y se adicionaron tratamientos con surfactinas a concentraciones finales de 10, 30 y 80 µM en DMEM con 2 % de SFB, con un mínimo de 3 réplicas técnicas por tratamiento. Las células sin tratamiento se emplearon como control negativo. Tras 24 h de incubación, se eliminaron los tratamientos, se colocó 100 µL de resazurina por pocillo y las células se incubaron 37°C, 5% CO2 durante 3 horas. Para determinar luego el porcentaje de viabilidad celular, se midió la fluorescencia a 590 nm (excitación a 570 nm) y se consideró el control negativo como el 100 % de viabilidad.
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% de hemólisis (control positivo como el 100 % de hemólisis)
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Citotoxicidad_de_Srf_de_cepas_de_Bacillus.xlsx
Actividad metabólica celular (fluorescencia de resazurina 570/590 nm)
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% viabilidad celular (control negativo como el 100 % de viabilidad celular)
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Actividad_hemol_tica_Srf_4_cepas.xlsx
Hemoglobina liberada (absorbancia a 540 nm)
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