Expresión estable de la proteína E2 del virus de la diarrea viral bovina en cultivos in vitro de tabaco y análisis de la respuesta inmune humoral en ganado inmunizado con extractos de hojas de tabaco agroinfiltradas que expresan la proteína E2

Abstract

Nuestro objetivo fue comparar los niveles de expresión de la proteína E2 del virus de la diarrea viral bovina (VDVB), expresada mediante transformación estable o transitoria, en plantas de tabaco. Además, se determinó la capacidad de inducción de anticuerpos neutralizantes anti-E2 en ganado mediante la inmunización con una vacuna experimental formulada con extracto de hojas de tabaco agroinfiltradas que expresan transitoriamente una versión de la proteína E2 de retención en retículo endoplasmático (E2-ER). Los callos y las suspensiones celulares obtenidos luego de la transformación estable expresaron las versiones de la proteína E2 direccionada al apoplasto (E2-Apo) y de retención en retículo endoplasmático. Los niveles de expresión en callos fueron de 3 µg/g de peso fresco (PF), lo que equivale a 1,15 % de las proteínas totales solubles (PTS). Ambas versiones de la proteína recombinante, E2-Apo y E2-ER, fueron detectadas en la biomasa de las suspensiones celulares, pero en niveles muy inferiores a los obtenidos para callos. La inmunización del ganado con una vacuna experimental, conteniendo extracto de hojas de tabaco agroinfiltradas (60 µg de E2-ER) y el adyuvante Al(OH)3 Hydrogel (90:10), indujo un alto nivel de anticuerpos anti-E2, con un 87,5 % de seroconversión y un título promedio considerado inmunoprotector. Podemos concluir que los niveles de expresión de la proteína E2 en callos son significativamente mayores que los obtenidos en suspensiones celulares, pero menores que los obtenidos mediante la expresión transitoria en hojas agroinfiltradas. El ganado inmunizado con la vacuna experimental mostró una respuesta humoral fuerte, lo que predice que puede ser utilizada en el desarrollo de una vacuna a subunidades contra VDVB.

Our goal was to compare transient y stable plant expression strategies for the production of the E2 protein from Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) and to test the ability to induce the production of neutralizing anti-E2 antibodies in cattle from an experimental vaccine containing agroinfiltrated tobacco leaf extracts expressing the E2-ER version. Stably transformed tobacco calluses y cell suspensions expressing the apoplast-directed (E2-Apo) y endoplasmic reticulum-retained (E2-ER) E2 protein versions have been established. The E2 expression levels in calluses were similar for both versions and were estimated to be 3 µg/g fresh weight (FW), corresponding to 1.15 % of total soluble protein (TSP). The E2-Apo y E2-ER proteins were detected in the biomass of cell suspension cultures but only after sample concentration, indicating that calluses produce higher levelsof E2 than cell suspension cultures. On the other hand, immunization of cattle with an experimental vaccine constituted by an aqueous extract containing E2 transiently expressed in tobacco leaves (60 µg of E2-ER) and Al(OH)3 Hydrogel adjuvant (90:10) produced a high level of anti-E2 antibodies (87.5 % seroconversion) with titers considered to be immunoprotective. The E2 expression levels in calluses were significantly higher than those obtained in cell uspension cultures but lower than those attained by transient expression in agroinfiltrated leaves. The immunized cattle developed a strong humoral response showing the potential of the plant-made E2 protein to develop a subunit vaccine against BVDB.