Moduladores del remodelamiento de la red de Extensinas durante el crecimiento polarizado en el pelo radical: Peroxidasas Apoplasticas y Cisteina-EndoPeptidasas

Abstract

Los pelos radicales son importantes para la absorción de nutrientes y agua del suelo y sirven de anclaje a la planta. Estos poseen un crecimiento polarizado, es decir que crecen en un solo sentido. Este tipo de crecimiento se caracteriza por tener un comportamiento oscilatorio, acompañado por un gradiente de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de iones Ca2+. Las paredes celulares en las plantas imponen límites al crecimiento. Por lo cual, debe sufrir modificaciones constantes para lograr la expansión. Las paredes celulares están compuestas por polisacáridos y proteínas ricas en hidroxiprolina (hydroxyproline-rich glycoproteins; HRPGs) que incluyen a las extensinas (EXTs). Estas últimas, están unidas covalentemente a través de sus residuos de tirosinas, formando una red. Las Peroxidasas apoplásticas (PERIII) son enzimas que llevan a cabo tres diferentes ciclos enzimáticos, llamados ciclo peroxidativo, ciclo hidroxílico y ciclo oxidativo. Durante su ciclo peroxidativo, las PERIII usan H2O2 como agente oxidante para producir radicales libres en componentes fenólicos y glicoproteínas estructurales que pueden, en forma subsecuente forman enlaces covalentes estables. Esta actividad contribuye a la rigidización de la pared celular y por lo tanto limita el crecimiento. Las PERIII pueden también causar la relajación de la pared celular mediante su ciclo hidroxílico, en el cual producen ROS, lo que provoca el clivaje de polisacáridos en forma no enzimática y un relajamiento general de la pared celular. Por lo tanto, las PERIII pueden cumplir roles opuestos en la expansión celular, dependiendo de las condiciones de crecimiento. Finalmente, en el ciclo oxidativo las PERIII generan radicales super-óxido (O2?-) a partir de la reducción de 1O2, que puede ser dismutado a H2O2, ya sea espontaneamoente o enzimaticamente mediante la superóxido dismutasa (SOD) modulando así, los niveles de ROS. En esta tesis, se identificaron a las PERIII involucradas en el crecimiento del pelo radical. Se determinó su función en la producción de ROS necesario para la expansión y los efectos que estas enzimas producen en la pared celular. También, se demostró que las PERIII están reguladas por el FT RSL4, el cual es activado por auxinas a través de ciertos factores de respuesta a auxinas (ARFs). Los ARFs implicados en este proceso también fueron identificados en este trabajo. Otras enzimas que podrían modificar la estructura de la pared celular son las Las Cisteína-Endo Peptidasas (CEPs). Éstas son capaces de clivar EXTs a nivel de prolina e hidroxiprolina glicosilada, razón por la cuál, se hipotetiza que podrían regular ya sea el desensamblado de la red de EXTs en el apoplasto y/o ejercer un control de calidad en aquellas EXTs mal procesadas (sub-glicosiladas o sobre-glicosiladas) en el sistema secretorio en el RE-Golgi. En esta tesis se determinaron cúales son las CEPs que se expresan en pelos radicales, se exploró el rol biológico de estas enzimas y su regulación transcripcional durante la expansión polarizada del pelo radical.

Root hairs are important for the absorption of water and nutrients from the soil and serve as an anchorage to the plant. These have a polarized growth, that is mean that, they grow only in one direction. This type of growth have an oscillatory behavior accompanied by Reactive Oxygen Species (ROS) and Ca2+ ions gradients. However, the walls in cell plants, impose limits on growth. Therefore, it must be modified to achieve expansion. Cell walls are composed by polysaccharides and glycoproteins rich in hydroxyproline (HRPGs) that include the Extensins (EXTs). EXTs are covalently linkages through their tyrosine residues, forming a red in cell wall. Apoplasic peroxidases (PERIII) are heme-containing enzymes secreted in the extracellular space where they perform three different enzymatic cycles, namely the peroxidative, hydroxylic and oxidative cycles. During the peroxidative cycle, the enzyme converts different substrates, including cell wall phenolic compounds and structural proteins, into free radicals that can subsequently combine together to form covalent linkages. This activity contributes to cell wall stiffening and therefore limits growth. PERIII can also cause cell wall loosening through the hydroxylic cycle, in which H2O2 and O2 − are used to generate hydroxyl radicals, including •OH, that lead to nonenzymatic cleavage of polysaccharides. Finally, PERIII can also generate O2 − , which is then dismutated into H2O2, during the oxidative cycle. Therefore PERIII can play opposite roles in cell expansion, being able to cause both wall stiffening and loosening, depending on the growth conditions. In this work we explored the role of PERIII in the production of ROS, root hair polar growth and in the cell wall. It was also shown that PERIII are regulated by the transcription factor RSL4, which is activated by Auxins (AUX) through certain auxin response factors (ARFs). In this way, the implication of the PERIII in the production of ROS necessary for the cellular elongation mediated by AUX was demonstrated. Other enzymes that can modify the cellular structure of the cells wall are the Cysteine-Endo Peptidases (CEPs) wich are capable of digesting the EXT. It is believed that they can disassemble the red of EXTs in the apoplast and / or do a quality control in those poorly processed EXTs (subglycosylated or over-glycosylated) in the secretory system in the RE-Golgi. In this work, the biological role of these enzymes in root hair is explored and it is demonstrated which are root hairs specific and how is its transcriptional regulation.