Efecto de LEC2 sobre la expresión de proteínas heterólogas en hojas de Nicotiana benthamiana

Abstract

Las plantas son el sistema más económico y seguro para la producción deproteínas farmacéuticas e industriales. Muchas de estas proteínas requieren deun procesamiento típico de la vía secretoria para alcanzar una conformaciónactiva y soluble. En sistemas como células de mamíferos y levaduras, la síntesisde proteínas foráneas en esta vía se encuentra limitada por la capacidad deplegamiento y transporte, utilizándose estrategias de ingeniería celular parasuperar estas limitaciones e incrementar los rendimientos. En células vegetaleseste tipo de estrategias no se han explorado. El objetivo de este trabajo fue evaluarel impacto del factor de transcripción LEC2, vinculado a la síntesis de reservas ensemillas, en la producción de proteínas foráneas en hojas. La hipótesis planteadaes que la expresión ectópica de LEC2 produciría cambios en el desarrollo de lavía secretoria conduciendo a mayores niveles de acumulación. Con este fin seutilizaron diferentes genes reporteros dirigidos por el promotor CaMV35S y el factor de transcripción LEC2 como efector que fueron introducidos en hojas deNicotiana benthamiana utilizando agrobacterias, comparándose los resultadosobtenidos con y sin efector. LEC2 no se une al promotor CaMV35S y los efectosobservados serían indirectos. Primero se estudió el impacto de LEC2 en lalocalización de marcadores fluorescentes de la vía secretoria mediantemicroscopía confocal de barrido láser (CLSM). GFP-HDEL (marcador del RetículoEndoplásmico, ER) y ST-GFP (marcador del Golgi) presentaron la mismalocalización en ambos casos, mientras que los marcadores de compartimientosprevacuolares (PVC), GFP-BP80, y vacuola, RFP-AFVY, son secretados enpresencia de LEC2, indicando una alteración post-Golgi del funcionamiento de lavía. Los análisis realizados por inmunoblot, mostraron que LEC2 produceaumentos de 2,5‐3,5 veces en la acumulación de proteínas retenidas en el ER yde 3‐6 veces para proteínas vacuolares. La presencia fluorescencia de GFP-BP80en el apoplasto llamó la atención ya que GFP suele ser inestable a pH ácido, porello se estudió el pH del apoplasto in vivo mediante CLSM en plantas deArabidopsis thaliana Apo-pHusion que expresan de forma estable el sensor de pHmRFP1?EGFP direccionado a apoplasto, observándose un aumento del pH enhojas infiltradas con LEC2 respecto a controles sin infiltrar o infiltrados con unvector vacío. Teniendo en cuenta que se ha informado que el apoplasto es uncompartimiento proteolítico se decidió evaluar la actividad proteolítica. Usandoazocaseína se evaluó la actividad de extractos de hojas de N. benthamianainfiltradas con un vector vacío o LEC2, obteniéndose valores de actividad del 50%y 25%, respectivamente, respecto a hojas sin infiltrar. En conclusión,demostramos que la expresión de LEC2 los niveles de acumulación de reporterosen la vía secretoria siendo una estrategia novedosa potencialmente aplicable tantopara plataformas de producción transitorias como estable.