Acción directa de microorganismos intestinales en líneas celulares de cáncer colorrectal

Abstract

Numerosas evidencias demuestran la importancia del microbioma, principalmente por su acción inmunológica, en el desarrollo de múltiples enfermedades, como el cáncer colorrectal (CCR). De acuerdo con trabajos previos, bacterias como Escherichia coli (E. coli) y Bacteroides fragilis (B. fragilis), entre otras, tienen una alta prevalencia en pacientes con CCR en comparación con la población normal. En este trabajo investigamos las posibles vías y señales que pueden contribuir al desarrollo del CCR por la acción directa de las bacterias sobre células de cáncer colorrectal, en ausencia de señales adicionales del sistema inmunitario. Comenzamos determinando la cantidad total de genes que estaban up o down regulados (log FC> 1 o <-1),según los datos de RNAseq, en experimentos con la línea celular DLD-1 de CCR infectada con E. coli durante2 h o Bacteroides fragilis enterotoxigénico (ETBF)durante 2 a 24 h a multiplicidad de infección (MOI): 500(base de datos GSE130152). Luego, realizamos un análisis bioinformático de sobrerrepresentación utilizando la herramienta bioinformática ConsensusPathDB. Descubrimos que ETBF up regula525 genes implicados en procesos como la migración celular, la respuesta inflamatoria y la transcripción de genes del ciclo celular mediada por FOXO (p<0,05).Mientras que E. coli up regula 2249 genes, la mayoría de ellos implicados en las vías de señalización TNF, NFkB,MAPK e inflamatorias (p< 0,05). Curiosamente, según lo determinado por los diagramas de Venn, ETBFy E. coli comparten 231 genes up regulados y 414 genesdown regulados. Para confirmar la probable incidencia de estas bacterias en el desarrollo de CCR, analizamos la presencia de ambas, utilizando la puntuación LDA(análisis discriminante lineal) en neoplasia scolorrectales de la base de datos GMrepo de metagenomas intestinales humanos y encontramos que tienen LDA> 4, por lo tanto, están fuertemente involucrados. Con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos por análisis bioinformático, realizamos experimentos de infección de la línea celular de CCRhumano HCT116 con microorganismos de muestras fecales de personas sanas (control) o con CCR de pacientes del Instituto Lanari. En primer lugar, hicimos ensayos de supervivencia y crecimiento celular mediante tinción con cristal violeta y determinación de absorbancia a 570 nm luego de la infección por 4 h e incubación durante 24 o 48 h con muestras de CCR o pacientes control a una MOI de 5, 10 o 15 (aeróbicos más anaeróbicos). Encontramos que todas las muestras inducen la muerte celular a las 24 h, no más del 50 +/-10 % para MOI 15. Sin embargo, las células sobrevivientes continuaron proliferando. A través de ensayos de inmunofluorescencia (IF) con una MOI 5,encontramos que todas las muestras indujeron la translocación nuclear de NF- -catenina y el coactivador del receptor nuclear RAC3, que se expresa altamente en células madre cancerosas. Sin embargo,-catenina nuclear se incrementó significativamente en las células estimuladas con muestras de CCR respecto al control (40 +/- 15%), donde también se observó una mayor expresión de Vimentina (p<0,05) y una disminución de la E-cadherina, (p<0,05) por IF, compatibles con un incremento de la transición epiteliomesenquimática(TEM).Concluimos que existen señales oncogénicas, TEM y vías independientes del sistema inmunitario que podrían ser inducidas directamente por bacterias en las células epiteliales colorrectales, contribuyendo al CCR.