Expresión de la proteína recombinante Wee1 de Trypanosoma brucei en Leishmania tarentolae

Abstract

La proteína Wee1 es unaquinasa de tirosina involucrada en la regulación de la transición G2/M delciclo celular eucariota. En nuestro laboratorio se caracterizò la protèina quinasaWee1 de Trypanosoma brucei (TbWee1) necesariapara la progresión del ciclo celular y el crecimiento de los parásitos (Boynaket al, 2013). El objetivo de nuestro trabajo es expresar la proteína TbWee1 recombinanteen su forma activa para realizar estudios de función e identificar sus putativossustratos. Dado que la expresión de TbWee1 en un sistema procariota produce unaproteína insoluble e inactiva, se decidió utilizar el sistema de expresión de Leishmania tarentolae. Al igual que T. brucei, L. tarentolae pertenece a lafamilia de tripanosomátidos y por lo tanto posee la maquinaria de modificaciónpost-traduccional eucariota. Por otra parte L.tarentolae no es patogénica para humanos, de fácil manipulación y de bajocosto de cultivo. El sistema de L.tarentolae también permite una expresión inducible por tetraciclina, que esespecialmente útil cuando la sobreexpresión de la proteína de interés resultatóxica. Otra ventaja de este sistema es que el vector tiene acoplada laco-expresión de la proteína fluorescente m-cherryjunto con la proteína de interés, que facilita la selección de clones positivos.Una mayor expresión de m-cherrycorrelaciona con una mayor expresión de la proteína de interés. La proteína TbWee1se clonò en el vector de expresión de L.tarentolae con una etiqueta de Histidina para facilitar la detección conanticuerpos y la purificación. Los parásitos fueron transfectados exitosamente porelectroporación e inducidos con tetraciclina por 24, 48 y 72 h para evaluar laexpresión. Esto se realizó midiendo la fluorescencia de m-cherry en un espectrofotómetro. Resultados preliminares mostraronun aumento de fluorescencia en los parásitos inducidos respecto al control noinducido. Además se detectò una disminución de la expresión a las 72 hpost-inducción. Por microscopía de fluorescencia se observò que dentro de lapoblación transfectada se encuentran parásitos que expresan distintos nivelesde m-cherry. Para enriquecer la poblaciónen parásitos de alta expresión se realizaron diluciones seriadas de los mismos.Empleando ensayos de western blot e inmunofluorescencia con el anticuerpo anti Histidinase tratarà de corroborar la expresión de TbWee1 en estos parásitos. Experimentosposteriores se realizaràn para determinar la actividad enzimática de TbWee1.Financiación: CONICET yANPCyT.