Evaluación de la influencia del tiempo de equilibrio "bacteria-glicerol" en la crioconservación a -20º C

Abstract

La congelación a -20°C es uno de los métodos de conservación transitoria más utilizado para el trabajo de laboratorio en Microbiología. Para minimizar los daños causados por el estrés osmótico y la formación de cristales de hielo se deben adicionar crioprotectores entre los que se destaca el glicerol, que ejerce su efecto protector penetrando en la célula microbiana. Este modo de acción hace necesario determinar el tiempo de equilibrio apropiado, previo al congelamiento, para que el glicerol atraviese la membrana plasmática e ingrese al microorganismo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del tiempo de equilibrio célula/glicerol previo al congelamiento, sobre la viabilidad durante el almacenamiento. En este estudio se empleó un cultivo concentrado de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CRL 494 de la Colección de Cultivos de CERELA, cultivado en caldo MRS a 37 °C hasta fase estacionaria temprana, resuspendido en leche extracto de levadura (LEL) con glicerol al 10 % (v/v). Los tiempos de equilibrio ensayados fueron 0, 30 y 60 min a 4 °C y la evaluación de la tolerancia a la conservación se realizó mediante ciclos de congelamiento /descongelamiento: luego de 24 h a -20 °C la cepa fue sometida a ocho ciclos sucesivos de congelación durante 1 h a -20 ºC y descongelación rápida durante 5 min en baño a 37 °C; en cada ciclo se determinó viabilidad celular por el método de diluciones sucesivas mediante siembra por microgota en MRS agar y las placas se incubaron 48 h a 37 ºC. Los datos se analizaron por regresión lineal y se aplicó ANOVA para la evaluación estadística. Las gráficas de regresión lineal de los valores de viabilidad obtenidos muestran que la afectación de la misma en los tiempos de equilibrio evaluados se encuentra en función de los ciclos de congelamiento /descongelamiento. Después de 8 ciclos, el índice de muerte celular sin tiempo de equilibrio previo fue de 0,38 mientras que para 30 y 60 min fue de 0,05. A pesar que no se observó diferencias significativas en el índice de muerte de ambos períodos de equilibrio, la variación de los ciclos afectó mínimamente la viabilidad celular en el último tiempo. Según estos resultados, el tiempo de equilibrio óptimo glicerol-célula sería de 60 min. Se comprobó que los ciclos de congelamiento/descongelamiento son una herramienta válida para evaluar factores que pudieran afectar la recuperación de los microorganismos en la criopreservación. En este trabajo se demuestra que el tiempo de equilibrio célula/protector es necesario para lograr una mayor recuperación del microorganismo, cuando se emplea un crioprotector penetrante como el glicerol.