Aspectos bioquímicos y moleculares de celobiohidolasas fúngicas con potencial aplicación en el proceso de sacarificación

Abstract

Las prácticas agrícolas generan desperdicios lignocelulósicos compuestos por celulosa, hemicelulosas y lignina que pueden ser bioconvertidos por hongos para generar productos de valor agregado como los biocombustibles. En este sentido, las enzimas celulolíticas como las endoglucanasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasas se presentan como una alternativa para su utilización en la hidrólisis de celulosa a azúcares que pueden ser fermentados a etanol.El objetivo general de esta tesis fue obtener un medio enriquecido en celobiohidrolasas a partir del cultivo de hongos políporos nativos de Misiones (Argentina) con características propicias para ser utilizados en el proceso de sacarificación, un paso clave en la producción de bioetanol.En un screening inicial, se evaluó el potencial celulolítico de 14 políporos mediante ensayos cualitativos seleccionándose 11 aislamientos que mostraron actividad endoglucanasa, celobiohidrolasa y β-glucosidasa.Luego, se realizó un screening cuantitativo en cultivos sumergidos y se seleccionó el aislamiento LBM 033 por presentar los mayores títulos de actividad enzimática para las tres celulasas. Además, los sobrenadantes de cultivo de cada aislamiento mostraron diferentes perfiles isoenzimáticos, correspondiendo la mayoría de las bandas a 45 kDa para las celobiohidrolasas y a un rango entre 69 y 88 kDa para las endoglucanasas.El aislamiento LBM 033 fue identificado como Trametes villosa mediante el uso de los marcadores ITS y rbp2 y la construcción de árboles.La celulosa cristalina, la peptona y el sulfato de amonio afectaron (P≤0,01) a la actividad celobiohidrolasa, obteniéndose la mayor actividad enzimática luego de 12 días de cultivo. Las condiciones del medio se estandarizaron, obteniéndose el valor óptimo de 49±5 U/l en las siguientes condiciones: 15 g/l de celulosa cristalina y 3 g/l de peptona y sulfato de amonio.El sobrenadante de cultivo estandarizado de T. villosa LBM 033 presentó el mayor valor de actividad celobiohidrolasa a 60°C y pH 4, 8. La termoestabilidad fue mayor a 30ºC seguida de 50ºC, disminuyendo a temperaturas más elevadas, mientras que la actividad enzimática fue más estable a los pHs 4, 8 y 10.El sobrenadante presentó además títulos elevados de otras actividades enzimáticas necesarias para la hidrólisis de los sustratos holocelulósicos, hidrolizando los sustratos artificiales celulósicos hasta celobiosa y glucosa. En la sacarificación del residuo de cebada pretratatado por extrusión, el porcentaje de sacarificación de la holocelulosa fue del 30 %, representado probablemente por oligosacáridos reductores.En el análisis del secretoma se logró identificar una CBHII. Además, el 66 % de las proteínas estuvieron relacionadas con la bioconversión de la biomasa lignocelulósica.Estos resultados indican que los macrohongos de Misiones, como T. villosa LBM 033 pueden constituir una valiosa fuente de celulasas, especialmente celobiohidrolasas que pueden aplicarse en la etapa de sacarificación lo que podría reducir el costo total de la producción de bioetanol.

The agricultural practices generate lignocellulosic waste composed of cellulose, hemicelluloses and lignin that can be bioconverted by fungi to generate value-added products such as biofuels. In this context, cellulolytic enzymes such as endoglucanases, cellobiohydrolases and β-glucosidases are presented as an alternative for their use in the hydrolysis of cellulose to sugars that can be fermented to ethanol. The general objective of this thesis was to obtain a medium enriched in cellobiohydrolases from the cultivation of native polypore fungi from Misiones (Argentina) with favorable characteristics to be used in the saccharification process, a key step in the production of bioethanol. In an initial screening, the cellulolytic potential of 14 polypores was evaluated by qualitative assays, selecting 11 isolates that showed endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase activity. Then, a quantitative screening was performed in submerged cultures and the LBM033 isolate was selected because it had the highest enzymatic activity titers for the three cellulases. In addition, the culture supernatants of each isolate showed different isoenzyme profiles, most of the bands corresponding to 45 kDa for the cellobiohydrolases and to a range between 69 and 88 kDa for the endoglucanases. The LBM 033 isolate was identified as Trametes villosa through the use of the ITS and rbp2 markers and the construction of trees. Crystalline cellulose, peptone and ammonium sulfate affected (P≤0.01) cellobiohydrolase activity, obtaining the highest enzymatic activity after 12 days of culture. The conditions of the medium were standardized, obtaining the optimum value of 49 ± 5 U / l under the following conditions: 15 g/l of crystalline cellulose and 3 g/l of peptone and ammonium sulfate. The standardized culture supernatant of T. villosa LBM 033 showed the highest value of cellobiohydrolase activity at 60° C and pH 4.8. The thermostability was higher at 30ºC followed by 50ºC, decreasing at higher temperatures, while the enzymatic activity was more stable at pHs 4, 8 and 10. The supernatant also showed high titers of other enzymatic activities necessary for the hydrolysis of the holocellulosic substrates, hydrolyzing the artificial cellulosic substrates up to cellobiose and glucose. In the saccharification of the pre-treated barley residue, the saccharification percentage of the holocellulose was 30 %, probably represented by reducing oligosaccharides. In the analysis of the secretome, a CBHII was identified. In addition, 66 % of the proteins were related to the bioconversion of the lignocellulosic biomass. These results indicate that macrofungi from Misiones, such as T. villosa LBM 033 can be a valuable source of cellulases, especially cellobiohydrolases that can be applied in the saccharification stage, which could reduce the total cost of bioethanol production.