Actividad antiviral de alcaloides naturales y sintéticos frente a los virus dengue y Zika

Abstract

Los virus dengue (DENV) y Zika (ZIKV), pertenecientes al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae, son importantes patógenos para el hombre para los cuales no se dispone aún de un tratamiento antiviral específico. Ambos se transmiten al hombre a través de la picadura de mosquitos del género Aedes, pero en el caso de ZIKV también se ha comprobado la transmisión congénita, perinatal y sexual. La infección por cualquiera de los cuatro serotipos de DENV puede resultar en una enfermedad febril benigna o en patologías severas conocidas como dengue grave. Si bien la infección por ZIKV suele ser asintomática o presentarse como una enfermedad febril, la infección durante el embarazo aumenta el riesgo de microcefalia, daño cerebral y anomalías congénitas. Por otra parte, estudios retrospectivos sugieren que la infección por ZIKV estaría asociada al desarrollo del síndrome neurológico de Guillain- Barré.El presente trabajo tuvo como objetivos la evaluación y caracterización de la actividad antiviral in vitro de β-carbolinas naturales y sintéticas frente a DENV y el estudio del efecto inhibitorio de la anisomicina frente a DENV y otros flavivirus en cultivos celulares, así como la evaluación de su eficacia en un modelo animal de infección por ZIKV.Se evaluó la actividad antiviral de un grupo de β-carbolinas naturales y sus derivados sintéticos frente a DENV-2 en cultivos celulares. Se determinó que el harmol, de origen vegetal, y un derivado sintético de la harmina, la 9N-metilharmina, exhiben efecto inhibitorio sobre la producción de DENV-2, siendo menos activos frente al resto de los serotipos de DENV. La caracterización del modo de acción antiviral de la 9N-metilharmina frente a DENV-2 demostró que el compuesto no afecta ni las etapas iniciales de la infección ni la síntesis de ARN viral. La 9N-metilharmina inhibiría la maduración y liberación de las partículas virales al medio extracelular impidiendo la propagación de la infección. Se determinó además que el efecto inhibitorio del compuesto no estaría relacionado con su capacidad de modular la vía de señalización celular p38 dependiente de proteínas quinasas activadas por mitógenos (p38 MAPK). Por su parte la anisomicina, un activador de la vía p38 MAPK, exhibió actividad antiviral frente a los cuatro serotipos de DENV y frente a aislamientos clínicos de DENV-2. Su efecto inhibitorio se demostró tanto en cultivos de células Vero como en líneas celulares humanas. Las cinéticas de entrada y de desnudamiento viral no fueron afectadas por el compuesto. Por el contrario, el tratamiento con anisomicina provocó una fuerte inhibición de la expresión de proteínas virales y de la síntesis de ARN viral indicando que el compuesto inhibe la síntesis de macromoléculas virales. La realización de ensayos enzimáticos permitió establecer que este compuesto no afecta de manera directa la funcionalidad de la proteína viral NS5. Por otra parte, el tratamiento con el compuesto alteró la cinética de activación de la vía p38 MAPK inducida por la infección viral. Dado que la anisomicina exhibió también efecto inhibitorio frente a otros flavivirus, se decidió evaluar su eficacia antiviral en un modelo animal de infección por ZIKV. El tratamiento con anisomicina de ratones AG129 infectados con ZIKV mostró un efecto reverso del compuesto, mientras la dosis más alta de compuesto ensayada produjo un efecto exacerbado de la infección viral, la dosis más baja empleada provocó el retraso de la muerte de los animales y una disminución significativa de la carga viral respecto a los animales tratados con placebo.En conclusión, en este trabajo se logró identificar dos tipos de alcaloides con actividad antiviral frente a los flavivirus, siendo la anisomicina el compuesto que mostró mayor eficacia y selectividad in vitro. Los resultados obtenidos en el ensayo in vivo sugieren que se requiere la realización de nuevos esquemas de tratamiento a fin de determinar el potencial terapéutico de la anisomicina para hacer frente a la infección por ZIKV.

Dengue virus (DENV) and Zika virus (ZIKV) belong to the Flavivirus genus of Flaviviridae family and are important human pathogens. No specific antiviral treatment is available for these viral infections. DENV is transmitted to humans by mosquitoes of the genus Aedes and although this is also the main form of transmission of ZIKV, congenital, perinatal and sexual transmission have also been demonstrated. Infection with any of the four serotypes of DENV (DENV-1 to DENV-4) causes a feverish acute benign disease or more severe forms of the disease. ZIKV infection is often asymptomatic or causes only mild symptoms, but infection during pregnancy increases the risk of microcephaly, brain damage, and congenital abnormalities. Furthermore, retrospective studies indicate that ZIKV can trigger GuillainBarré syndrome. The aims of the present thesis were the evaluation and characterization of the in vitro antiviral activity of natural and synthetic β-carbolines against DENV and the study of the inhibitory effect of anisomycin against DENV and other flaviviruses in cell cultures, as well as the evaluation of its antiviral efficacy in an animal model for ZIKV infection. The antiviral activity of a group of natural β-carbolines and their synthetic derivatives against DENV-2 in Vero cell cultures was evaluated. Harmol, a natural β-carboline, and a synthetic analog of harmine, 9N-methylharmine, exhibited inhibitory effect on the production of DENV-2 but were less active against the other DENV serotypes. The analysis of 9Nmethylharmine mode of action showed that the compound does not affect neither early stages of viral multiplication nor viral RNA synthesis. 9N-methylharmine would inhibit the maturation and release of viral particles to the extracellular medium impairing the spread of the infection. In addition, it was also determined that the antiviral activity of 9Nmethylharmine is not related to the ability of this compound to regulate the activation of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) cell signaling pathway. On the other hand, anisomycin, an alkaloid that stimulates p38 MAPK pathway activation, exhibited inhibitory effect against the four DENV serotypes and also against DENV-2 clinical isolates in Vero cells. The compound also displayed antiviral action against DENV-2 in human cell cultures. The kinetics of DENV-2 entry and uncoating were not affected by anisomycin. In contrast, treatment with the compound resulted in a strong inhibition of viral protein expression and viral RNA synthesis indicating that anisomycin inhibits viral macromolecular synthesis. Enzymatic assays proved that this compound does not affect the activities of NS5 viral protein. On the other hand, anisomycin altered the kinetics of p38 MAPK activation induced by viral infection. Since the compound also presented in vitro antiviral activity against other flaviviruses, we decided to evaluate its antiviral efficacy in an animal model for ZIKV infection. Anisomycin treatment of AG129 mice infected with ZIKV showed a reverse effect: the highest dose of compound employed promoted viral replication whereas the lowest dose assayed produced a delay in the time of mice death and a significant reduction in viral load with respect to placebo treated mice. In conclusion, in the present study we identified two types of alkaloids with antiviral activity against flaviviruses, being anisomycin the most effective and selective compound in cell culture assays. The results obtained in the in vivo experiment suggest that the evaluation of other treatment protocols are needed to further determine the therapeutic potential of anisomycin to deal with ZIKV infection.