Secuenciación masiva de miARNs en una población susceptible y una resistente a insecticidas piretroides del vector de la Enfermedad de Chagas Triatoma infestans

Abstract

Se extrajo ARN total y miARNs a partir de ninfas de estadio V de la colonia susceptible originada a partir de individuos provenientes de la localidad de Chuña y de la colonia resistente de Pampa Argentina. Cada muestra consistió en un pool cuerpo graso de 5 machos y 5 hembras. La extracción se realizó mediante el kit mirVanaTM miRNA Isolation de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se verificó la concentración de ARN total (fluorómetro Qubit) e integridad del mismo por electroforesis desnaturalizante en gel de agarosa. Para la secuenciación de nueva generación (NGS) se remitieron las muestras de ARN total para la construcción de las librerías y la secuenciación masiva al servicio técnico especializado brindado por la empresa ArrayStar (EEUU). Para el análisis bioinformático de Raw data de más de 64 (Ti1R), 72 (Ti2R) y 93(Ti3R) millones y 50 (Ti1S), 146 (Ti2S) y 67 (Ti3s) millones de lecturas sin procesar de las réplicas S1, S2 y S3 de poblaciones susceptibles y R1, R2 y R3 respectivamente se utilizaron herramientas del programa CLC Genomics Workbench v9.5. Se procesaron los datos crudos para remover lecturas de baja calidad, de secuencias poliA, de adaptadores, de secuencias sin adaptador 3’ y de secuencias más cortas a 15 nucleótidos. Se obtuvieron 62 (Ti1R), 70 (Ti2R) y 90 (Ti3R) millones de lecturas procesadas y 48 (Ti1S), 143 (Ti2S) y 65 (Ti3S) millones de lecturas procesadas. Los datos de lecturas recortadas de cada biblioteca se anotarán mediante su comparación con la base de datos de miARNs de miRBase, así también como con miARNs que se caracterizarán a partir del genoma de R. prolixus y con las secuencias de transcriptomas de T. infestans, T. dimidiata y T. pallidipennis, y otras especies de hemípteros presentes en la base de datos Vectorbase. Subsecuentes recuentos relativos de miARNs se realizaron dentro de cada librería. Para predecir nuevos miARNs se utilizó el software miRDeep2. Utilizando el program miRDeep 2 se identificaron 120 miARNs y se caracterizaron 20 miARNs nuevos. Se encuentra en desarrollo el análisis de la expresión diferencial de miARNs entre las poblaciones de T. infestans susceptible y resistente a insecticidas piretroides se determinan los niveles de expresión de las miARNs se lleva a cabo con el comando “Annotate and Merge” en el programa CLC Genomics Workbench v9.5. Este procedimiento utilizó a miRBase como base de datos primaria y la base de datos de ARNs no codificantes (dmell-RNAt-6.1/8fasta y demell-allmiscRNA-6.1/8.fasta) como base de datos secundaria de anotación. El número de lecturas se normalizó usando el método de etiquetas por millón de lecturas o método de TPM. TPM= (número de lecturas corridas por cada miARN en relación al total de lecturas corridas) x 106. Posteriormente, el algoritmo de Análisis Empírico de la Expresión Diferencial del Gen (Empirical Analisys of Differential Gene Expression o EDGE) se utilizó para estimar las diferencias en el número de lecturas para las poblaciones susceptible y resistente, con valores P ajustados por cálculos de múltiples pruebas, empleando el procedimiento de Benjamini-Hochberg para tasa de falso descubrimiento (false discovery rate: FDR).