Aplicación de la tecnología CRISPRi para silenciar genes en las arqueas

Abstract

CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated) es un mecanismo que han desarrollado los procariotas (bacterias y arqueas) para defenderse de elementos genéticos invasores. Si bien existen diferentes versiones, todas tienen en común dos componentes esenciales para su funcionamiento: las proteínas Cas y ARNs reguladores (crRNAs). Las proteínas Cas son guiadas por el crRNA hacia una secuencia diana específica que es luego degradada por las proteínas Cas. El sistema CRISPR-Cas (tipo II CRISPR-Cas-9) ha sido adaptado y se aplica como herramienta para la edición de genomas y regulación de la expresión génica en bacterias y eucariontes. En las arqueas el sistema CRISPR-Cas se encuentra ampliamente distribuido (90 %) y uno de los más caracterizados es el de Haloferax volcanii, organismo que se desarrolla en ambienteshipesalinos (>1,5 M NaCl) y es considerado un modelo para estudios fundamentales de la biología arqueana. H. volcanii contiene un sistema CRISPR-Cas tipo I-B compuesto por tres loci CRISPR yocho proteínas Cas, entre las cuales Cas3 es la endonucleasa que degrada al ADN diana. Elsistema endógeno de H. volcanii ha sido modificado para silenciar genes, ampliando de este modo la disponibilidad de estrategias moleculares para manipular la genética y fisiología en estos organismos. La tecnología CRISPR de interferencia (CRISPRi) en H. volcanii permite reprimir la expresión de genes esenciales para explorar su función, es aplicable a genes localizados en cromosomas y plásmidos, tanto monocistrónicos como localizados en operones. En base a estos antecedentes, en nuestro grupo aplicamos CRISPRi sobre el gen codificante de la proteasa LonB y sobre un gen de función desconocida en H. volcanii. LonB es una proteasa esencial para esta haloarquea y un regulador negativo de la producción de pigmentos carotenoides dado que afecta la degradación de una enzima clave de la ruta carotenogénica. Se diseñaron varios ARN guía (crRNAs) complementarios a la región promotora y sitio de inicio de transcripción, con los que se transformaron células de una cepa de H. volcanii carente de los genes cas3 y cas6b (cepa HV30). Se analizó la eficiencia del silenciamiento génico (Northern y Western blotting) y el fenotipo de lastransformantes. Para el gen lonB (HVO_0783) se obtuvieron colonias hiperpigmentadas con un incremento de al menos 5 veces en el contenido del carotenoide bacterioruberina, consistente con una represión del gen lonB cercana al 70 %.