Respuesta vascular al estrés: efecto protector del bisfosfonato alendronato.

Abstract

Considerando que los bisfosfonatos (BP) son fármacos de primera línea en el tratamiento de la osteoporosis postmenopáusica, período en el cual la prevalencia de enfermedades cardiovasculares en mujeres se incrementa significativamente, el objetivo fue estudiar el efecto del BP alendronato (ALN) en la respuesta vascular al estrés ambiental extracelular. Enfocamos la investigación en las alteraciones de los patrones de crecimiento y migración celular y sobre la capacidad de reparación vascular por angiogénesis. Se emplearon cultivos primarios de células endoteliales (CE) y células de músculo liso vascular (CMLV) aisladas de aorta murina. Para inducir condiciones de estrés, los cultivos se expusieron al agente proinflamatorio LPS o se incubaron en un medio pro-osteogénico (MO: B-glicerolfostato 5 mM y CaCl2 4 mM), inductor de la transdiferenciación de CMLV a linaje óseo. Empleando el ensayo de MTT, se evaluó el efecto de ALN sobre la proliferación de CMLV. El tratamiento con ALN (96h, 1, 5 y 10 µM) no modificó el perfil de crecimiento celular. En presencia de LPS la proliferación aumentó significativamente (31% vs control, p<0.02), efecto que se suprimió completamente con la adición del BP. El estrés inducido por el MO se manifestó por un marcado incremento de la proliferación (108% vs control, p<0.001), estímulo que se redujo parcialmente con la presencia simultánea de ALN. Empleando inhibidores selectivos de las vías mensajeras MAPK (PD98059, 5 μM) y PKC (chelerythrine, 1 μM) se demostró que el mecanismo de acción del ALN sobre el estrés inducido por MO involucra la participación de ambas vías, ya que el pretratamiento con chelerythrine o PD98059 anuló parcialmente el efecto de ALN sobre la proliferación inducida por MO. Por su parte los resultados obtenidos al evaluar el crecimiento celular en presencia de L-NAME 10 µM (inhibidor de NOS: óxido nítrico sintasa) muestran que la vía NOS dependiente es la que media la acción del BP sobre el estrés inducido por LPS. Al estudiar la migración de CMLV (técnica de wound healing) se observó que el bisfosfonato exhibió un patrón de movilidad celular similar al del grupo control. El tratamiento de las CMLV con LPS o MO incrementó significativamente la migración (20% y 25%, LPS y MO, respectivamente, p<0.02), efecto revertido por la presencia concomitante del ALN. Para evaluar la angiogénesis se utilizó un ensayo de formación de tubos. Para ello, las CE se sembraron sobre un gel de fibrina, y se cuantificó la longitud total de los tubos formados por microscopía óptica empleando el software ImageJ. El BP estimuló significativamente la formación de tubos luego de 4 días de tratamiento (5.34±0.48 vs 7.52±0.5; mm, control vs ALN 5 μM; p<0.05). Demostramos que el efecto proangiogénico del BP es mediado por VEGF, ya que la presencia del compuesto SU5416 (1 μM), antagonista del receptor de VEGF, suprimió completamente la formación de tubos inducida por el fármaco. La participación de VEGF en el mecanismo de acción del ALN se corroboró al determinar que ALN 5 μM incrementa la síntesis de VEGF por parte de las CE (35.7% sobre el control, p<0.05, ensayo ELISA). Cabe destacar que, bajo condiciones de estrés (LPS o MO) la acción proangiogénica de ALN no se vio afectada. En resumen, los resultados presentados sugieren que, en condiciones de estrés vascular, ALN exhibe una acción protectora de la homeostasis vascular preservando los patrones de crecimiento y movilidad celular y promoviendo la angiogénesis.