Estandarización de un método para la extracción de DNA a partir de muestras clínicas parafinadas

Abstract

La epidemiología molecular estudia variaciones genotípicas relacionándolas con diversos procesos biológicos, entre ellos los patológicos como el cáncer. Por ello el análisis de muestras clínicas parafinadas es de gran importancia para el diagnóstico, la prevención y la terapia. Se ha informado con anterioridad muchos problemas relacionados con la amplificación de DNA obtenido a partir tejido embebido en parafina (TEP). En este trabajo se comparó la capacidad de 9 metodologías para obtener DNA a partir de TEP y amplificarlo por PCR para analizar fragmentos de menos de 250 pb correspondientes con polimorfismos presentes en enzimas pertenecientes a la vía del folato. El método modificado de Salting-out con NaCl de 0,5 M, CTAB 2 % como detergente y Proteinasa K fue el más adecuado para obtener DNA amplificable considerando los amplicones elegidos. Todos los métodos mostraron una mejor amplificación con ciclos más prolongados y temperaturas de annealing menores comparado con DNA más íntegro.

Molecular Epidemiology includes genotypic studies of different biological processes, including pathological diseases such as cancer. Therefore, the paraffin-embedded clinical samples analysis is very important for diagnosis, prevention and therapy. Previously, many problems associated with amplification of DNA obtained from paraffin-embedded tissue samples were reported. This paper compares the capability of nine methodologies for DNA extraction from paraffin-embedded clinical samples, amplifying it by PCR to analyze under-250-bp fragments corresponding to folate pathway enzymes polymorphisms. Modification of "salting-out" method with concentrations of 0.5 M NaCl and 2 % CTAB detergent and Proteinase K was the most suitable for amplifiable DNA obtention of selected amplicons. All methods showed better amplification with longer cycles and lower annealing temperatures as compared to less fragmented DNA samples.