Análisis del potencial génico para la degradación de glifosato en bacterias rizosféricas de Avena sativa L

Abstract

El glifosato es un herbicida del grupo de los organofosfonatos, usado en el control de malezas en cultivos transgénicos, barbechos químicos y para la desecación de cultivos de cobertura. Los efectos del herbicida sobre comunidades microbianas rizosféricas han sido comparativamente menos estudiados que los efectos en suelo no rizosférico. Los mismos pueden ser indirectos, mediados por la modificación de los exudados radicales o directos por la exudación del glifosato a través del sistema radical. Esto último podría conducir al enriquecimiento de bacterias con capacidad de metabolizar fosfonatos. El objetivo de este trabajo fue diseñar cebadores específicos para detectar y cuantificar el potencial génico para la degradación de glifosato en bacterias. Los cebadores phnJF1 y phnJR2 se diseñaron en base a 42 secuencias disponibles en base de datos, incluyendo secuencias pertenecientes a los fila Proteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes y Cianobacteria, del gen codificante para C-P liasa (phnJ), una enzima clave en la degradación del glifosato. En función de la hipótesis se diseñó un ensayo con plantas de Avena sativa L. (cultivo de cobertura) como modelo experimental, en macetas con suelo con historia de uso de glifosato. Luego de 67 días de crecimiento las plantas fueron sometidas a: 1) corte (con tijeras, control); 2) secado con glifosato (Roundup, 6,8 µl/maceta= 4 l ha-1 ). Se tomaron muestras de suelo rizosférico 4 y 26 días luego del tratamiento, se extrajo el ADN con un kit comercial y se utilizó como molde para PCR cuantitativa (qPCR) con los cebadores phnJF1/ phnJR2. El ADN amplificado fue examinado en gel de agarosa, purificado y ligado a un vector de clonación para transformar células competentes de Escherichia coli. Se seleccionaron de 16 clones para ser secuenciados por Macrogen (Corea). Los datos de abundancia de copias de phnJ fueron analizados mediante un ANOVA doble. El número de copias del gen en el suelo control fue 6,85 × 108 copias/μg de ADN y en el tratamiento con glifosato 8,29 × 108 copias/μg de ADN. Si bien no se detectaron diferencias significativas, los resultados sugieren un enriquecimiento en bacterias degradadoras de glifosato por medio de la vía C-P liasa posiblemente relacionado con la exudación de este compuesto. Las secuencias obtenidas fueron alineadas con secuencias depositadas en Genbank, confirmando la especificidad de los cebadores para la detección y cuantificación de un fragmento de ~200 pb del gen phnJ.