Estudios moleculares que asocian el síndrome metabólico y el cáncer de próstata

Abstract

El cáncer de próstata (CaP) ocupa el segundo lugar en incidencia y es la quinta causa de muerte por cáncer en hombres en el mundo. En nuestro país es el tipo de cáncer de mayor incidencia y la tercera causa de muerte por cáncer en la población masculina. Es por lo tanto un problema de salud pública de suma importancia. Entre los factores de riesgo más relevantes al CaP encontramos la edad, el origen étnico, los antecedentes familiares, las hormonas, la exposición a determinadas substancias químicas y el estilo de vida. Dentro de este último factor de riesgo podemos incluir la dieta. Los microRNAs (miRNAs) son moléculas pequeñas, 19 a 22 nucleótidos, de RNA no codificante que tienen un rol fundamental en la regulación de la expresión génica. En mamíferos su mecanismo principal de acción es la represión de la traducción del mRNA mediante el apareamiento de bases entre el miRNA y una secuencia semilla ubicada, generalmente, en el extremo 3´ UTR del mRNA. Dado que no es requerida la complementariedad de bases exacta, un mismo miRNA puede regular la expresión de una gran variedad de genes, potencialmente silenciando por completo una vía celular determinada. Así como ocurre con los genes convencionales, los miRNAs pueden ser considerados pro o antitumorales y de la misma manera se los encuentra desregulados en cáncer. Hace 10 años se descubrió que algunos miRNAs son activamente secretados por las células, pudiéndolos encontrar en circulación en condiciones normales así también como en condiciones patológicas. Todas las características mencionadas hacen de los miRNAs moléculas interesantes para ser estudiadas en cáncer no sólo como uno de los tantos mecanismos que se encuentran desregulados en esta patología, sino además como posibles biomarcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad. El síndrome metabólico (SM) es otro problema grave de salud pública en el mundo moderno. Se lo describe como un conjunto de desórdenes fisiopatológicos cuyo diagnóstico requiere la detección de al menos 3 de los siguientes factores: obesidad visceral, triglicéridos elevados, bajos niveles de colesterol HDL, hipertensión y niveles elevados de glucemia en ayunas. El estudio del rol del SM en cáncer ha cobrado importancia en los últimos años. Un meta-análisis reciente encontró que existe una correlación significativa entre el SM y la agresividad y recurrencia bioquímica de tumores de próstata. C-terminal binding protein 1 (CTBP1) es un co-represor transcripcional cuya actividad requiere la unión de NAD+ o NADH, sin embargo es 100 veces más afín por el segundo por lo que es considerado un sensor del estado metabólico celular. Dado que su actividad se ve incrementada en condiciones de alta energía y que entre sus genes blanco se encuentran distintos supresores tumorales, es un candidato atractivo como posible vínculo entre el SM y cáncer. En trabajos previos de nuestro laboratorio empleando un modelo murino encontramos que el silenciamiento de CTBP1 en tumores de próstata xenotransplantados llevaba a una drástica disminución del crecimiento tumoral únicamente en animales con SM. El RNA obtenido de muestras de los xenotransplantes fue hibridado con un microarreglo de expresión del genoma completo y con un microarreglo de expresión de miRNAs, obteniéndose una lista de genes y una de miRNAs regulados por CTBP1 en condiciones de SM. A partir de estos resultados continuamos trabajando en este proyecto de tesis. Como primer objetivo nos planteamos el análisis y la validación de los resultados del microarreglo de expresión génica. Nos centramos en aquellos genes regulados por CTBP1 pertenecientes al proceso de adhesión celular. Fuimos capaces de validar los resultados del microarreglo tanto por RT-qPCR como mediante ensayos funcionales de adhesión celular. Encontramos que la sobre expresión de CTBP1 favorece el fenotipo mesenquimal, disminuye la adhesión celular y aumenta el potencial invasivo de las células tumorales prostáticas. Por el contrario, el silenciamiento de CTBP1 induce un aumento de la adhesión celular lo cual se evidencia en el incremento de la superficie de membrana plasmática en contacto con el sustrato.A continuación desarrollamos dos modelos in vivo de CaP y SM. El primer modelo nos facilitó el estudio de metástasis espontáneas. Brevemente, ratones de la cepa NOD scid gamma (NSG) de 4 semanas de edad fueron alimentados con una dieta control (DC) o una dieta enriquecida en grasa (DG), luego de 12 semanas los animales fueron inoculados con células PC3 con expresión disminuida de CTBP1 (PC3.shCTBP1) o control (PC3.PGIPZ). Al cabo de 4 semanas los animales fueron sacrificados y se tomaron muestras de tumor, pulmón y sangre para su posterior análisis histológico y/o por RT-qPCR según correspondiese. Encontramos que el silenciamiento de CTBP1 disminuyó significativamente el número y el tamaño de los focos metastásicos en los pulmones de los animales con SM. En el segundo modelo se trabajó con ratones de la cepa C57BL/6J, también de 4 semanas de edad, a los que se les administró una DC o una DG. Estos animales fueron inoculados en la semana 15 de dieta con células TRAMP-C1 sin modulación de la expresión de CTBP1. Luego de aproximadamente 8 semanas se sacrificaron los animales y se colectaron muestras de tumor, pulmón y sangre para su análisis posterior. Estos animales representaron una condición más aproximada al estado de SM ya que presentaban alteración de colesterol, glucosa en ayunas, esteatosis hepática, aumento de estradiol y sobrepeso. A su vez, presentaron un aumento del tejido adiposos gonadal y mesentérico. En cuanto al volumen tumoral, el SM incrementó de manera significativa el crecimiento de los mismos así como la expresión de CTBP1 que fue acompañada de una disminución en la expresión de E-cadherina (CDH1). En cuanto al microarreglo de miRNAs, validamos un grupo de miRNAs vinculados al proceso de adhesión celular. Además, detectamos por RT-qPCR 4 miRNAs en el plasma de ratones NSG xenotransplantados, de los cuales el miR-30b-5p se encontraba significativamente disminuido en la circulación de animales con SM e inoculados con células con expresión control de CTBP1. Finalmente nos abocamos al análisis de los miRNAs circulantes como biomarcadores en muestras de plasma de pacientes enrolados en 2 centros de salud de la Provincia de Buenos Aires. Los pacientes con CaP, vírgenes de tratamiento, fueron divididos en subcategorías de acuerdo al grado de Gleason de sus tumores y si presentaban o no parámetros relacionados con el SM. Por otro lado se colectaron muestras de pacientes con hiperplasia prostática benigna (HPB) y voluntarios sanos. Estos 2 grupos también fueron subdivididos en individuos que presentaban parámetros asociados al SM e individuos que no. Afortunadamente pudimos encontrar varios candidatos a ser estudiados en el futuro como posibles biomarcadores de CaP asociado a SM. En resumen en este trabajo de tesis se describe por primera que CTBP1 disminuye la adhesión celular, favoreciendo un fenotipo mesenquimal y pro-invasivo y que desempeña un rol crucial en la progresión del CaP desde el tumor localizado hasta la metástasis. Siendo esto mediante la regulación génica tanto de forma directa, en su rol de co-represor transcripcional, como a través de los miRNAs que comanda. Por último, comenzamos la etapa exploratoria en la búsqueda de biomarcadores de CaP asociado a SM, desarrollando las herramientas necesarias para la detección de miRNAs en plasma de pacientes y estableciendo las bases que nos permitirán encontrar miRNAs candidatos a ser analizados minuciosamente en el futuro como biomarcadores.

Prostate cancer (PCa) occupies the second place in incidence and is the fifth cause of death by cancer among males worldwide. In our country PCa is the most common cancer type and the third cause of death by cancer in the male population. Therefore it is, a highly relevant public health concern. The more important risk factors for PCa are age, ethnicity, familiar history, hormones, certain chemical substances and life style. Diet can be included in this last risk factor. MicroRNAs (miRNAs) are small molecules, 19 to 22 nucleotides, of noncoding RNA that play a critical role in gene expression regulation. In mammals, its main mechanism of action is the repression of mRNA translation by base pairing between the miRNA and a seed sequence located, generally, at the mRNA´s 3´ UTR. Since exact base pairing is not mandatory a single miRNA can regulate numerous genes, potentially silencing an entire cellular pathway. As it happens with conventional genes, miRNAs can be considered pro or anti-tumor, and are also deregulated in cancer. Around 10 years ago it was discovered that miRNAs can be actively secreted by cells and circulate in blood on normal and pathological conditions. These characteristics make miRNAs an interesting molecule to be evaluated as a possible diagnostic or prognostic biomarker for PCa. Metabolic syndrome (MS) is another major public health concern in today´s world. It is described as a set of physiopathological disorders whose diagnosis requires the detection of at least 3 of the following factors: visceral adiposity, high triglycerides, low levels of HDL cholesterol, hypertension and high fasting glucose levels. In the last couple of years the study of MS role on cancer has gain importance. A recent meta-analysis has found a significant correlation between MS and PCa tumor aggressiveness and biochemical recurrences. Abstract C-terminal binding protein 1 (CTBP1) is a transcriptional co repressor whose activity requires NAD+ or NADH binding. However since it´s affinity is 100 fold higher for NADH, it´s considered a sensor of the metabolic state of the cell. Based on its activity is increased on highly energy conditions and on many of its targets are tumor suppressor genes, CTBP1 becomes an attractive candidate as a possible link between cancer and MS. Previously our group used a murine model to demonstrate that CTBP1 depletion, in PCa xenografts, leads to a dramatic decrease in tumor growth only on MS mice. RNA samples isolated from xenografts tumors was used to hybridized a whole genome expression microarray and a miRNA expression microarray, obtaining a list of genes and a list of miRNAs regulated by CTBP1 on MS conditions. From these data we started working on this thesis project. Our first aim was the analysis and validation of the results of the gene expression microarray. We focus on those genes regulated by CTBP1 related to cell adhesion. By RTqPCR and cells adhesion functional assays we were able to validate the microarray results. We found that CTBP1 over expression favors a mesenchymal phenotype, reduces cell adhesion and increases the invasive potential of prostate tumor cells. On the contrary, CTBP1 depletion stimulates cell adhesion which is made evident by an increase in cell surface attached to substrate. Next we developed two in vivo models of PCa and MS. The first model allowed for the study of spontaneous PCa metastasis. Briefly, 4 weeks old NOD scid gamma (NSG) mice were fed with a control diet (CD) or a high fat diet (HFD), after 12 weeks of treatment the animals were inoculated with CTBP1 depleted PC3 cells (PC3.shCTBP1) or control (PC3.PGIPZ). Four weeks later, animals were sacrificed and tumors, lungs and blood samples were collected for RT-qPCR and histological analysis. We found that CTBP1 depletion leads to a significant decrease in the number of metastatic foci in lungs of MS animals. For our second model we worked with 4 weeks old C57BL/6J mice, which were also fed with a CD or a HFD. These animals were inoculated on the 15th week of diet with TRAMP-C1 cells without CTBP1 expression manipulation. After approximately 8 weeks, animals were sacrificed and tumors, lungs and blood samples were harvested for further analysis. These mice showed a more accurate MS like disease, since they have cholesterol and glucose alteration, hepatic Abstract steatosis, high cholesterol and overweigh. Also, we observed an increase in gonadal and mesentheric adipose tissue. A significant increase in tumor volume and CTBP1 expression was observed in the MS group, along with a lower expression of E-cadherin (CDH1). Regarding the miRNA microarrays, we validated a group of miRNAs linked to cell adhesion. We analyzed plasma samples of NSG mice bearing xenografts and detected, by RT-qPCR, 4 circulating miRNAs of which hsa-miR-30b-5p was significantly decreased in the circulation of MS animals that were inoculated with PC3 cells with control expression of CTBP1. Finally we focused on the study of circulating miRNAs as possible biomarkers on patient plasma samples from two health care centers in Buenos Aires. PCa patients, previous to therapy, were divided on different subcategories depending on Gleason Score and whether or not they presented parameters associated to MS. We also collected samples from patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) and healthy donors. Individuals in these two groups were also divided based on parameters associated to MS. Luckily we were able to find several candidates for future analysis as possible biomarkers of PCa associated to MS. In summary, in this thesis we described for the first time that CTBP1 diminishes cell adhesion, favoring a mesenchymal and pro-invasive phenotype and that plays a crucial role in PCa progression from localized tumors to metastases, by direct gene regulation, as a transcriptional co-repressor, or indirectly through miRNAs. Finally, we began the exploratory phase in the search for biomarkers of PCa associated to MS, developing the necessary tools for the detection of miRNA in patient’s plasma samples and establishing the bases that will allow us to find the candidates to be thoroughly analyzed in the future as biomarkers.