PCR para detectar leptospiras patógenas en muestras clinicas animales

Abstract

El Grupo de Investigación del Laboratorio de Leptospirosis (Centro de Referencia OIE) perteneciente al Instituto de Patobiología ubicado en el INTA de Castelar, trabajó en el marco del Proyecto Nacional de Sanidad Animal 1115052, Módulo Zoonosis reemergentes de impacto socio económico, en una PCR de tiempo final para la detección de ADN de leptospiras patógenas a partir de muestras clínicas de animales de producción.Esta PCR utilizó los cebadores modificados (primers): G1 (5'- CTG AATCGCTGTATAAAAGT) y G2 (5'-GGAAAACAAATGGTCGGAAG), éstos amplificaron una banda de 246-285pb a partir del ADN de todas las especies patógenas de Leptospira spp., exceptuando L. kirschneri. Los cebadores B64I (5'-CTGAATTCTCATCTCAACTC) y B64II (5'GCAGAAATCAGATGGACGAT) amplificaron un producto de 542-563 pb a partir de ADN de L. kirschneri. La mix para la reacciones de PCR, de volumen final de 50 μl estaba compuesta de la siguiente manera: 10X buffer: 500mM-KCL, 20mM MgCl2, 100mM-Tris/HCL, pH 9.0, 0.5 μl de una solución de 50μmol de cada primer, 0.5 μl de una mix conteniendo 10mM de cada desoxinucleico dATP, dTTP, dCTP,y dGTP, Taq polimerasa (0.5U) y agua destilada libre de nucleasas. De templado (molde) de ADN se utilizaron entre 2 μl. El programa de ciclado fue de 94ºC durante 5 minutos (desnaturalización), 34 ciclos de 94°C por 1,5 minutos, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, la extensión final fue de 72°C durante 7 minutos.Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio y se utilizó un transiluminador de luz UV (Uvi Tec transiluminator BTS-20.M). Los tamaños de las bandas se determinaron con un marcador molecular de 100bp (Embiotech). Se incluyeron controles negativos para asegurar que no haya contaminación ambiental y un control positivo. Se probó esta PCR con muestras de órganos, suero y orina con resultados favorables. Esta herramienta diagnóstica permite discriminar si la leptospira es patógena o no.