PCR-RFLP method for testing ASIP EXON 4 mutations in llamas

Abstract

The basic coat colors of mammals are determined by the relative proportion of two types of pigments, eumelanin and pheomelanin. The agouti signaling protein (ASIP) plays a crucial role in melanogenesis, by increasing the production of pheomelanin and decreasing the eumelanin synthesis by blocking the signaling pathway of the melanocortin 1 receptor (MC1R). In several species, loss of function mutations of the ASIP gene is responsible for the black coat color. The polymorphisms of ASIP exon 4, c.325_381del and c.292C> T, have been previously associated with eumelanic phenotypes in llamas (Daverio et al., 2016) and also in alpacas (Chandramohan et al., 2013). The objective of this work was to develop an alternative method to DNA sequencing for genotyping both polymorphisms. Fifty one llama DNA samples, including controls of known sequence were analyzed. PCR products spanning ASIP exon 4 were digested with the enzyme Bvel, that recognizes the c.292C>T mutation, followed by electrophoresis in 8% polyacrylamide gels to simultaneously detect the SNP and the deletion. Analysis of the band patterns presented complete concordance between DNA sequencing and PCR-RFLP genotypes. Genotyping results from the samples showed that all dark llamas (n=13) were homozygous for the deletion, homozygous for the c.292C> T polymorphism or heterozygous for both, while none of these combinations were observed in the pheomelanic animals here analyzed (n=20). The results of this work support the findings of previous studies and also show the usefulness of the PCR-RFLP technique as a relatively fast, simple and cost-effective method to determine the ASIP exon 4 variants in llamas.

Los colores de capa básicos de los mamíferos están determinados por la proporción relativa de dos tipos de pigmentos, eumelanina y feomelanina. La proteína de señalización agouti (ASIP) juega un rol crucial en la melanogénesis, incrementando la producción de feomelanina y disminuyendo la síntesis de eumelanina por bloqueo de la vía de señalización del receptor 1 de melanocortina (MC1R). En varias especies, mutaciones con pérdidas de función del gen ASIP son responsables del color de capa negro. Los polimorfismos del exón 4 de ASIP, c.325_381del y c.292C> T, han sido asociados previamente con fenotipos eumelánicos en llamas (Daverio et al., 2016) y también en alpacas (Chandramohan et al., 2013). El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método alternativo a la secuenciación de ADN para genotipar ambos polimorfismos. Se analizaron 51 muestras de ADN de llamas, incluyendo controles de secuencia conocida. Los productos de PCR que abarcan el exón 4 de ASIP fueron digeridos con la enzima Bvel, que reconoce la mutación c.292C> T, seguida por electroforesis en geles de poliacrilamida al 8 % para detectar simultáneamente el SNP y la deleción. El análisis de los patrones de banda presentó concordancia completa entre los genotipos de secuenciación y los de PCR-RFLP. Los resultados de genotipado de las muestras mostraron que todas las llamas oscuras (n=13) eran homocigotas para la deleción, homocigotas para el polimorfismo c.292C> T o heterocigotas para ambos, mientras que ninguna de esas combinaciones se observó en los animales feomelánicos aquí analizados (n=20).Los resultados de este trabajo apoyan los hallazgos de estudios previos y también muestran la utilidad de la técnica de PCR-RFLP como un método relativamente rápido, sencillo y de bajo costo para determinar las variantes del exón 4 de ASIP en llamas.