Estrategias comparativas de cribado de proteasas fúngicas y su proyección al cultivo sumergido para síntesis de bioactivos

Abstract

La diversidad de perfiles metabólicos y la notable capacidad para producir enzimas extracelulares con propiedades fisicoquímicas destacables, hace de los hongos filamentosos una fuente prometedora para este tipo de bioactivos. Su coexistencia en ambientes naturales, junto a una enorme biodiversidad con la que deben competir por alimento o espacio, y también para garantizar su supervivencia, los hace capaces de producir compuestos y actividades para enfrentar competidores o predadores. Así, las proteasas pueden ser parte de diversas estrategias para el hongo productor, no sólo para alimentarse y competir por nutrientes, sino también como mecanismos de patogenicidad, predatorismo, etc. A nivel industrial, estas enzimas poseen amplia aplicación en manufacturas alimentaria, farmacéutica y biotecnológica. En este estudio se compararon dos estrategias para la exploración del potencial proteolítico en organismos fúngicos nativos. De 194 muestras recolectadas en Las Yungas tucumanas, se obtuvieron unos 200 aislamientos autóctonos en estado puro y con morfotipos únicos, los que fueron ensayados por su habilidad para producir actividad proteasa, tanto asociada al cultivo, como liberada al medio extracelular. Los aislamientos fueron crecidos a 30°C durante 7 días en medio MYSA 10%-C agar suplementado con leche al 0.5% p/v, registrando diariamente crecimiento y ha- los radiales externos de clarificación. Se calculó la productividad proteolítica (Pdv, cm halo ext./día) a los 5 y 7 días. Asimismo, se obtuvieron exudados extracelulares (ECE) por congelación/descongelación (-15°C/24°C, 2 ciclos) de placas completas, seguido de centrifugación (10.000 × g, 15 min), y posterior recuperación de cada sobrenadante. Los ECEs fueron evaluados en placas agar soft-leche 0.5% p/v, realizando pocillos (3 mm Æ) y adicionando 30 µL de cada ECE. Luego de incubar (6 h a 30°C), se midieron los diámetros (cm) de los halos de proteólisis. La evaluación in vivo (durante el cultivo) dio (+) para 55 aislamientos (27.5% del total) con valores de Pdv de 0.02 a 0.39 cm radial/día. De este análisis resultaron seleccionadas 8 cepas (Pdv 0.20-0.39 cm/día). Al aplicar la segunda metodología, se registraron 66 ECEs (33% del total) con valores (+) y diámetros de clarificación entre 0.30 y 1.75 cm. De esta evaluación se seleccionaron 12 cepas (halos entre 1.40 y 1.75 cm). La metodología por crecimiento directo en leche podría evidenciar no sólo la actividad extracelular sino también ligada a pared/ membrana pudiendo asemejarse más al contexto de una fermentación en sustrato sólido. Mientras, en la segunda técnica quedaría expuesta la actividad netamente extracelular, lo que probablemente refleje mejor el entorno de una producción en cultivo sumergido. Los resultados indican que ambas metodologías son relevantes para detectar un perfil productor de proteasa. La prevalencia de dicha actividad en la micobiota estudiada fue bastante representativa (~30%), permitiendo seleccionar 20 cepas con 4 casos de coincidencia entre técnicas (CAM 6, LF 3.13, FIB 135 y PL jif). Los organismos promisorios según ambas técnicas serán evaluados para producir actividad fibrinolítica, así como también enzimas terapéuticas. Estos resultados exponen un valioso ecosistema con alta diversidad fúngica que debe ser explorado y valorizado como fuente de bioactivos de alto valor agregado.