La S1P y la ceramida regularían la integridad de la monocapa del epitelio pigmentario de la retina

Abstract

Objetivos: La disrupción del epitelio pigmen- tario de la retina (EPR) es clave en enfermedades retinoproliferativas. Demostramos que la esfingosina-1-fosfato (S1P), endógena y exógena, preservan la morfología e interacciones celulares del EPR. Estudiamos ahora si la S1P endógena requiere ser exportada al exterior celular para su acción y si esfingolípidos bioactivos como la ceramida–1-fosfato (C1P) y ceramida regulan la morfología celular. Materiales y métodos: Incubamos cultivos de ARPE-19, línea de EPR humana con PF543 o NVP-231, inhibidores de esfingosina quinasa 1 (SphK1) y ceramida quinasa (CerK), respectivamente; con C1P o C2-ceramida o con SLB1122168 (SLB), inhibidor de Spinster-2 (Spns2), transportador de S1P. Analizamos migración por el ensayo de la herida, viabilidad mediante MTT, y morfología celular y uniones estrechas (UE) por inmunocitoquímica, con faloidina y ZO-1. Resultados: La inhibición de Spns2 no afectó la morfología ni las UE, preservando a ZO-1 en la membrana plasmática. En ausencia de síntesis endógena de S1P, la C1P aumentó significativamente las células elongadas, del 33% (PF543) al 56% (PF543 + C1P). La inhibición de la síntesis de C1P, que provoca acumulación de ceramida, indujo retracción celular y deslocalización de ZO-1, y la C2-Ceramida tuvo efectos semejantes. Conclusión: Estos resultados sugieren que la S1P endógena actúa como mensajero intracelular y no es exportada al espacio extracelular. La C1P no preservaría la morfología celular, mientras que la acumulación de ceramida, por agregado de C2-ceramida o inhibición de la síntesis de C1P, provocaría la retracción celular y la disrupción de la integridad de la monocapa epitelialPurpose: Disruption of the retinal pigment epithelium (RPE) is key in retinoproliferative diseases. We demonstrated that endogenous and exogenous sphingosine-1-phosphate (S1P) preserves RPE morphology and cellular interactions. We now studied whether endogenous S1P requires export to the cell exterior for its action and whether bioactive sphingolipids such as ceramide-1-phosphate (C1P) and ceramide regulate cellular morphology. Materials and methods: We incubated ARPE- 19 cells, a human RPE cell line, with PF543 or NVP-231, sphingosine kinase 1 (SphK1) and ceramide kinase (CerK) inhibitors, respectively; with C1P or C2-ceramide, or with SLB1122168 (SLB), an inhibitor of Spinster-2 (Spns2), the S1P transporter. We analyzed migration by the wound assay, viability by MTT, and cell morphology and tight junctions (TJs) by immunocytochemistry, with phalloidin and ZO-1, respectively. Results: Inhibition of Spns2 did not affect morphology or TJs, preserving ZO-1 at the plasma membrane. In the absence of endogenous S1P synthesis, C1P significantly increased the number of elongated cells, from 33% (PF543) to 56% (PF543 + C1P). Inhibition of C1P synthesis, which causes ceramide accumulation, induced cell retraction and ZO-1 delocalization, and C2-Ceramide had similar effects. Conclusion: These results suggest that endogenous S1P acts as an intracellular messenger and is not exported to the extracellular space. They also suggest that C1P does not preserve cellular morphology, whereas ceramide accumulation, either through C2-ceramide addition or inhibition of C1P synthesis, induces cell retraction and disrupts the integrity of the epithelial monolayer