Contaminación de ecosistemas acuáticos por el insecticida Imidacloprid. Sensibilidad de diferentes biomarcadores en biomonitores animales y vegetales

Abstract

El aumento de las áreas naturales destinadas a la agricultura y el consecuente uso de plaguicidas aplicados sobre los cultivos genera preocupación y merece ser estudiado desde el punto de vista ecotoxicológico. El insecticida imidacloprid (IMI) fue el primer neonicotinoide incorporado masivamente en la agricultura, y hoy en día es uno de los compuestos más estudiados debido a su presencia en el ambiente y sus efectos en la biota silvestre. No obstante, sus efectos en organismos de ecosistemas acuáticos son escasamente conocidos. Los objetivos de la presente tesis fueron: 1) determinar los efectos de IMI en el crecimiento y las concentraciones de pigmentos fotosintéticos de la macrófita acuática Myriophyllum quitense; 2) analizar la distribución del IMI en los diferentes tejidos del pez dulceacuícola Australoheros facetus, 3) estudiar biomarcadores de estrés oxidativo: a)enzimáticos de exposición como la actividad de catalasa (CAT), glutatión reductasa (GR), glutatión-S-transferasa (GST), guaiacol peroxidasa (POD) y superóxido dismutasa (SOD) y las concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2) y b) de daño como MDA y grupos carbonilo en A. facetus y en M. quitense, 4) cuantificar biomarcadores de daño genético como la frecuencia de micronúcleos (MN), la fragmentación del ADN y la oxidación de bases del ADN en A. facetus y 5) comparar la sensibilidad de estos biomarcadores de manera de seleccionar aquellos más sensibles en la especie más adecuada, a ser usada en futuros estudios de biomonitoreo de zonas sujetas a contaminación por IMI. Se realizaron bioensayos utilizando concentraciones de relevancia ambiental del IMI, así como, en algunos casos, concentraciones mayores capaces de dilucidar mecanismos de distribución y toxicidad en los organismos. Los resultados del capítulo 1 mostraron que el IMI no afectó el crecimiento de la macrófita M. quitense luego de 14 días de exposición, si bien afectó las concentraciones de pigmentos fotosintéticos a altas concentraciones en ese tiempo, y disminuyó la concentración de clorofilas totales en plantas expuestas entre 1- 100 μg/L IMI luego de 48 hs. Los bioensayos agudos realizados con el fin de testear el posible efecto de estrés oxidativo no mostraron cambios en la actividad de las enzimas antioxidantes evaluadas en la curva de concentración respuesta;si bien se observó la disminución de las actividades de CAT y POD a 100 μg/L IMI en la curva tiempo- respuesta. Sin embargo, se detectó un incremento de las concentraciones de H2O2 y MDA a 10 μg/L IMI luego de 48 hs de exposición, efecto que no se mantuvo a 100 μg/L IMI a juzgar por los datos de las curvas de concentración- y tiempo- respuesta donde no se observaron diferencias con el control negativo. En el capítulo 2 se observó la capacidad de incorporación del IMI en A. facetus. Los factores de bioconcentración (FBC) permitieron definir que este agroquímico, debido principalmente a su naturaleza hidrofílica, no se bioacumuló. Sin embargo, fue detectado en los tejidos del pez predominando en el intestino y el hígado. En el capítulo 3 se analizaron los biomarcadores de estrés y daño oxidativo en A. facetus, demostrándose que la actividad de las enzimas antioxidantes difiere en los organismos control dependiendo del tejido analizado. En los peces expuestos a 1, 10, 100 y 1000 μg/L IMI no se observaron diferencias en las actividades de CAT, GST y GR. Sin embargo, en el hígado se detectó una inhibición de la enzima SOD y un incremento de H2O2 a 100 y 1000 μg/L IMI. En el encéfalo y en la branquia se observó una condición hiperoxidativa caracterizada por la inhibición de SOD a 100 y 1000 μg/L IMI, acompañado por el incremento de los niveles de MDA. Los datos obtenidos en el capítulo 4 evidenciaron la genotoxicidad concentración dependiente del IMI en A. facetus. Particularmente, la frecuencia de MN se incrementó en peces expuestos a 1000 μg/L IMI luego de 48 hs de exposición, mientras que el análisis de la fragmentación del ADN mostró daño a 100 y 1000 μg/L IMI representando un incremento promedio de 50 y 70 % respectivamente, en comparación con el control negativo. Se observó además un incremento en la oxidación de las bases pirimidínicas del ADN entre 1- 1000 μg/L IMI. Los resultados de esta tesis demuestran la importancia de analizar la sensibilidad de los biomarcadores en la selección de los organismos biomonitores ante la exposición a IMI. Así, a partir de los datos plausibles de ser comparados entre ambas especies, A. facetus mostró respuestas de los biomarcadores de estrés oxidativo a partir de la concentración de 100 μg/L IMI, mientras que M. quitense lo hizo a partir de un orden de magnitud menor. Sin embargo, estas respuestas fueron menos robustas en M. quitense. A partir de los resultados obtenidos en los biomarcadores de estrés oxidativo, al comparar los datos de M. quitense y A. facetus se observó que los datos en M. quitense no fueron reproducibles entre las curvas de concentración- y tiempo- respuesta; mientras que en A. facetus las respuestas entre ambas curvas fueron consistentes. Finalmente, podemos concluir que IMI produjo efectos tóxicossubletales en las dos especies biomonitoras propuestas en concentraciones de relevancia ambiental (10-100 μg/ L IMI), alertando sobre la necesidad de, no sólo monitorear las concentraciones de IMI presentes en los cuerpos de agua superficiales, sino también de estudiar efectos tales como estrés oxidativo y genotoxicidad en las especies que allí habitan.

The increasing use of natural areas for agricultural activities and the associated use of pesticides is a current concern and it deserves to be studied from an ecotoxicological point of view. The insecticide imidacloprid (IMI) was the first neonicotinoid massively incorporated in the agriculture, and since its introduction it has been taking over the market. Currently, IMI is one of the most studied compounds due to its presence and effects in wildlife, although its effects in aquatic organisms are scarcely known. The objectives of this thesis were: 1) to determine effects of IMI in growth and photosynthetic pigment concentrations in the aquatic macrophyte Myriophyllum quitense; 2) to analyze the distribution of IMI in different tissues of the freshwater fish Australoheros facetus, 3) to study biomarkers of oxidative stress: a) of exposure: enzyme activities of catalase (CAT), glutathione reductase (GR), glutathione- S- transferase (GST), guaiacol peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) and the concentration of hydrogen peroxide (H2O2) and b) of damage: the concentration of malondialdehyde (MDA) and carbonyl groups in A. facetus and in M. quitense, 4) to quantify biomarkers of genetic damage like the micronucleus frequency (MN), DNA fragmentation and oxidation of DNA bases in A. facetus, and 5) to compare the sensitivity of these biomarkers in order to select those more sensitive in the best biomonitor to be used in future studies for biomonitoring purposes. Bioassays were carried out using environmentally relevant concentrations of IMI, as well as other higher ones in order to elucidate mechanisms of distribution and toxicity in the organisms. The results of chapter 1 showed that IMI did not affect the growth of M. quitense after 14 days of exposure, although it changed the concentrations of chlorophylls at high concentrations at that time, and it decreased the pigments in plants exposed to 1-100 µg/L IMI after 48 h. The bioassays that were designed for testing the potential effect of oxidative stress showed no changes in the activities of the antioxidant enzymes in the concentrationresponse curves; although a decrease of CAT and POD activities at 100 µg/L IMI in the time- response curve was observed. At 10 µg/L IMI increased concentrations of H2O2 and MDA after 48 h were observed. These effects were not maintained at 100 µg/L IMI, judging by data from the concentration- and time- response curves where no differences from the control were observed. In chapter 2 the incorporation of IMI in A. facetus was studied. The bioconcentration factors (BCF) allowed to define that IMI, mainly due to its hydrophilicity, was not bioaccumulated. However, it was detected in different tissues and it predominated in gut and liver. In chapter 3, the study of biomarkers of oxidative stress and oxidative damage in A. facetus demonstrated that the basal activity of antioxidant enzymes differed among tissues. In fishes exposed to 1, 10, 100 and 1000 µg/L IMI no differences in the activities of CAT, GST and GR were observed. However, in liver an inhibition of SOD and an increment of H2O2 at 100 and 1000 µg/L IMI were observed. In brain and gills a hyperoxidative condition characterized by the inhibition of SOD at 100 and 1000 µg/L IMI was evident, in addition to an increment of MDA levels. Data from chapter 4 showed a concentration- dependent effect of genotoxicity of IMI in A. facetus. The frequency of MN increased in fishes exposed to 1000 µg/L IMI after 48 h, while DNA fragmentation occurred at 100 and 1000 µg/L IMI, representing an increment of 50 and 70 %, respectively. In addition, an increment of pyrimidinic DNA bases oxidation at 1- 1000 µg/L IMI was observed. The results of this thesis demonstrated the importance of analyzing the sensitivity of biomarkers in the selection of biomonitor organisms. Comparing data from both species, A. facetus showed responses of oxidative stress from 100 µg/L IMI, while M. quitense at one order of magnitude lower than the fish. However, these responses were less robust because of the low reproducibility between the concentration- and time- response curves. Concluding, IMI exerted sublethal toxic effects in both biomonitors at environmentally relevant concentrations (10- 100 µg/ L IMI), alerting over the need of monitoring the concentrations of IMI in surface water bodies and of studying biomarkers of oxidative stress and genotoxicity in the selected species.