Conjugados nanopartículas magnéticasporfirina para la inactivación fotodinámica de microorganismos

Abstract

La resistencia de los microorganismos a diferentes antimicrobianos ha aumentado considerablemente en los últimos años. Por lo tanto, es necesario desarrollar terapias alternativas para el control y tratamiento de enfermedades infecciosas. Así, la inactivación fotodinámica (PDI) ha sido propuesta como una estrategia emergente para la erradicación de patógenos. En este sentido, el uso de agentes fototerapéuticos inmovilizados en una matriz sólida permite la recuperación con posterioridad al tratamiento y una aplicación sustentable. En este trabajo de Tesis Doctoral se sintetizaron conjugados de derivados de porfirinas unidos a nanopartículas magnéticas. El núcleo magnético de Fe3O4 funcionalizado directamente con grupos amino (MNPNH2) resulta ser un soporte inadecuado para inmovilizar fotosensibilizadores (PSs) debido a la baja estabilidad. Sin embargo, este núcleo recubierto con una capa de sílica y luego funcionalizado con grupos amino (MNPSINH2) mostró ser un soporte estable. En primer lugar, se inmovilizó una porfirina aniónica (TCPP) sobre dichas nanopartículas. Mediante espectroscopía UV-visible se corrobora la unión del PS al soporte. Estudios cinéticos con distintos sustratos indican que TCPP inmovilizada produce eficientemente especies reactivas de oxígeno (ROS). Estudios in vitro de PDI con la levadura Candida albicans y las bacterias Staphyloccocus aureus (Gram positiva) y Escherichia coli (Gram negativa), muestran una considerable disminución de la viabilidad celular de los tres microorganismos. El resultado más interesante es que el conjugado es reciclable y reutilizable en la inactivación de microbios hasta, al menos, tres veces. Estos resultados motivaron la síntesis de nuevos PSs que adquieren cargas positivas en la periferia del macrociclo tetrapirrólico y de esta manera, se pueden obtener conjugados que interaccionan mejor con las células microbianas. Así, se diseñaron porfirinas con simetría A3B y ABAB, con carácter anfifílico sustituidas por grupos amino y perfluorofenilo. Dichos PSs muestran una importante actividad fotodinámica en solución. Además, se observa elevada PDI de los microorganismos, siendo A3B el más eficiente. Por otro lado, estas porfirinas se inmovilizaron sobre MNPSINH2. Estudios cinéticos e in vitro muestran que el conjugado formado tiene buena actividad fotodinámica y una eficiente PDI de S. aureus. Sin embargo, la principal desventaja de este procedimiento es el bajo rendimiento en la obtención de porfirinas asimétricamente sustituidas. Por lo tanto, se decidió trabajar con una porfirina perfluorada (F20TPP) con simetría A4, la cual se obtiene con mayor rendimiento. Este nuevo conjugado MNPSINH-F19TPP se modificó in situ para obtener grupos amino sobre la periferia del macrociclo. El conjugado MNPSIN + -F16TPP-N + , el cual contiene cargas positivas sobre los grupos amino de las nanopartículas y de las porfirinas, es el más eficiente en la PDI de microorganismos y además, puede ser reutilizado. Finalmente, la exploración del desarrollo de nuevas estructuras para anclar a las nanopartículas, lleva a la utilización de BODIPYs. Estas moléculas basadas en la mitad del macrociclo tetrapirrólico presentan un procesos de síntesis y purificación son más sencillos. A partir de un BODIPY fluorescente y otro con elevada actividad fotodinámica se diseñaron conjugados MNPSINH-BODIPYs. Así, fue posible obtener un conjugado que actúa como fluoróforo para la detección de infecciones y otro como agente fototerapéutico con elevada eficiencia para la erradicación fotodinámica de microorganismos.

The resistance of microorganisms to different antimicrobials has increased in recent years. Therefore, it is necessary to develop alternative therapies for the control and treatment of infectious diseases. Thus, photodynamic inactivation (PDI) has been proposed as an emerging strategy for the eradication of pathogens. In this sense, the use of immobilized phototherapeutic agents in a solid matrix allows the recovery of it after treatment and a sustainable application. In this PhD thesis, conjugates of porphyrin derivatives linked to magnetic nanoparticles were synthesized. The magnetic core of Fe3O4 functionalized directly with amino groups (MNPNH2) turns out to be an inadequate support to immobilize photosensitizers (PSs) due to the low stability. However, this core coated with a layer of silica and then functionalized with amino groups (MNPSiNH2) was a stable support. First, an anionic porphyrin (TCPP) was immobilized on these nanoparticles. The union of the PS to the support was observed by means of UV-visible spectroscopy. Kinetic studies with substrates indicate that immobilized TCPP efficiently produces reactive oxygen species (ROS). In vitro studies of PDI with the yeast Candida albicans and the bacteria Staphyloccocus aureus (Gram-positive) and Escherichia coli (Gram-negative) show a considerable decrease in the cell viability of these microorganisms. The most interesting result is that the conjugate is recyclable and reusable in the inactivation of microbes up to at least three times. These results motivate the synthesis of new PSs that acquire positive charges in the periphery of the tetrapyrrolic macrocycle. In this way, the conjugates can have a better interaction with microbial cells. Thus, porphyrins with A3B and ABAB symmetry were designed with amphiphilic character bearing amino and perfluorophenyl groups. These PSs show an important photodynamic activity in solution. In addition, the PDI of the microorganisms was observed, being A3B the most efficient. On the other hand, these porphyrins were immobilized on MNPSiNH2. Kinetic and in vitro studies show that the conjugate presents appropriated photodynamic activity and an efficient PDI of S. aureus. However, the main disadvantage of this process is the low yield in obtaining asymmetrically substituted porphyrins. Therefore, a perfluorinated porphyrin (F20TPP) with A4 symmetry was used, which can be synthetized in higher yield. This new conjugate MNPSiNH-F19TPP was modified in situ to obtain amino groups on the periphery of the macrocycle. The conjugate MNPSiN+ -F16TPP-N + , which contains positive charges on the amino groups of nanoparticles and porphyrins, is the most efficient in the PDI of microorganisms and can also be reused. Finally, the exploration of the development of new structures for nanoparticles leads to the use of BODIPYs. They are based on half of the tetrapyrrole macrocycle and have a simplest synthesis and purification processes. From a fluorescent BODIPY and another with high photodynamic activity, novel conjugates were designed MNPSiNH-BODIPYs. Thus, it was possible to obtain a conjugate that acts as fluorophore for the detection of infections and another as a phototherapeutic agent with higher efficiency for the photodynamic eradication of microorganisms.