Sequence-based microsatellites: High-throughput genotyping in the non-model Neotropical tree species Anadenanthera colubrina var. cebil (Leguminosae)

Abstract

La secuenciación mediante la tecnología Next-generation sequencing (NGS) permite el desarrollo de datos genotípicos de cientos de individuos, partiendo de la obtención de secuencias cortas de ADN mediante la técnica shotgun-sequencing de genoma completo, reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex e indexadas por cebadores para separar las lecturas de cada secuencia. El objetivo general del presente desarrollo tecnológico fue generar datos SSRseq para una especie forestal no modelo mediante la tecnología de genotipificación basada en NGS. Se desarrollaron 60 nuevos marcadores genéticos, específicamente, marcadores microsatélites basados en secuencias (SSRseq) para la especie forestal nativa Anadenanthera colubrina var. cebil (Leguminosae). Se procesó un total de 542 muestras individuales de hojas, se realizó el pesaje de las muestras y la extracción de ADN genómico total desde hojas de individuos adultos y plántulas resultantes de la germinación de semillas cosechadas a partir de árboles madre. Se extrajo ADN genómico total aplicando el protocolo de extracción CTAB (Doyle, 1991, modificado por M. Heuertz en 2021) en el laboratorio de la Plataforma de Biología Molecular de la unidad mixta de investigación (UMR) Biogeco (Biodiversité, Gènes et Communautés) del INRAE (Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Francia). Se evaluó la calidad y cantidad de ADN extraído utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 2000, analizando la pureza de las muestras mediante la comparación de valores numéricos de transmitancia y absorbancia en las longitudes de onda 260/280 y 260/230. La concentración final de ácidos nucleicos fue superior a 80 ng/μL. Se procedió a la amplificación y el desarrollo de bibliotecas de marcadores mediante secuenciación de alto rendimiento empleando la metodología propuesta por Lepais et al. (2020) en la plataforma Genome Transcriptome Facility of Bordeaux (PGTB) de la UMR Biogeco.