Estrategias de rizorremediación de glifosato en suelos bajo explotación agrícola intensiva

Abstract

La Pampa Húmeda es la principal región agrícola de Argentina y una de las más importantes de Sudamérica. Allí, el modelo de producción agrícola prevalente implica un uso intensivo de agroquímicos, cuyos residuos ponen en riesgo tanto la salud humana como el equilibrio de los ecosistemas. Considerando la extensión de la región, la necesidad de preservar la calidad de los suelos y evitando limitar la actividad económica, las técnicas de remediación de bajo costo y aplicación in situ resultan la mejor opción para eliminar los niveles residuales de glifosato. La rizorremediación, entendida como el uso de plantas y los microrganismos asociados a su raíz para remover los contaminantes del medio ambiente, surge entonces como la tecnología más promisoria. En este contexto, el objetivo general del presente trabajo de tesis es generar el conocimiento que permita desarrollar un sistema de rizorremediación capaz de mitigar el impacto asociado al uso de glifosato en suelos de la Pampa Húmeda Argentina bajo explotación agrícola intensiva. Para alcanzar dicho objetivo, se desarrollaron e implementaron metodologías para evaluar la tolerancia radicular y foliar a glifosato en especies vegetales con valor productivo. Posteriormente se realizó el aislamiento y caracterización fenotípica y genotípica de cepas bacterianas tolerantes y degradadoras de glifosato. Durante la caracterización, dos cepas fueron seleccionadas para profundizar su estudio, proceso que involucró la secuenciación de sus genomas completos. Por último, se realizaron ensayos de interacción planta-microorganismo y un ensayo de microcosmos en donde se expusieron diferentes sistemas de rizorremediación a una dosis agronómica de glifosato en suelo. Entre las especies vegetales evaluadas, L. corniculatus fue seleccionada como candidata por ser capaz de tolerar la exposición a 5,0 mg Kg-1 de glifosato por vía radicular y 700 g ha-1 por vía foliar. Se obtuvo un banco de cepas puras y se realizó la caracterización fisicoquímica de los suelos y el estudio de las comunidades microbianas presentes. Se observó que, al momento de explicar las diferencias entre comunidades microbianas, el efecto rizosférico prevalece sobre las características edáficas o aplicaciones crónicas con glifosato. Casi la totalidad de los microorganismos aislados pertenecen a la clase Alphaproteobacteria, y cumplieron los requerimientos de: tolerar la máxima concentración de glifosato reportada en suelos III agronómicos, utilizar glifosato como única fuente de fósforo, y poseer distintas capacidades de promoción de crecimiento vegetal, mostrando todas las cepas al menos tres resultados positivos. Se secuenció el genoma completo de Ochrobactrum sp. P6BS-III y Rhizobium sp. P44RR-XXIV, dos cepas que presentaron excelente performance en los ensayos previos, y cuyo genoma no había sido secuenciado previamente o estudiado en profundidad. Mediante comparación in silico genoma a genoma se obtuvo información complementaria respecto a la estructura del genoma de Rhizobium sp. P44RR-XXIV. A la vez, el genoma de Ochrobactrum sp. P6BS-III aportó una gran cantidad de genes al pool génico del género, muchos de ellos sin función conocida. Por último, se estudió la interacción planta-microorganismo entre cepas bacterianas degradadoras y L. corniculatus, mediante ensayos de inoculación en placas verticales, estudios de imágenes utilizando microscopía confocal y microscopía electrónica, y ensayos de microcosmos. En los ensayos en placas verticales las cepas estudiadas pudieron coexistir con la especie vegetal sin provocar ningún signo de daño en ésta, aunque no existieron diferencias significativas para los parámetros biométricos analizados. Las imágenes obtenidas a partir de microscopía evidenciaron los distintos patrones de colonización de Ochrobactrum sp. P6BS-III y Rhizobium sp. P44RR-XXIV en raíces de L. corniculatus. El ensayo de microcosmos develó que L. corniculatus inoculado con Ochrobactrum sp. P6BS-III podría atenuar casi completamente 5 mg Kg-1 de glifosato en suelo al cabo de 20 días, tiempo más que alentador para el sistema remediador propuesto.

The Pampa Húmeda is the main agricultural region of Argentina and one of the most important in South America. There, the prevailing agricultural production model implies an intensive use of agrochemicals, whose residues put at risk both human health and the balance of ecosystems. Considering the extension of the region, the need to preserve the quality of the soils and avoiding limiting the economic activity, low-cost remediation techniques and on-site application are the best option to eliminate residual levels of glyphosate. The rhizoremediación, understood as the use of plants and microorganisms associated with its root to remove pollutants from the environment, then emerges as the most promising technology. In this context, the main objective of this thesis work is to generate the knowledge that allows developing a rhizoremediation system capable of mitigating the impact associated with the use of glyphosate in soils of the Argentine Humid Pampas under intensive agricultural exploitation. To achieve this aim, methodologies were developed and implemented to evaluate root and foliar tolerance to glyphosate in plant species with productive value. Subsequently, phenotypic and genotypic isolation and characterization of glyphosate tolerant and degrading bacteria were performed. During the characterization, two strains were selected to deepen their study, a process that involved the sequencing of their complete genomes. Finally, plant-microorganism interaction trials and a microcosm assay were carried out, where different rhizoremediation systems were exposed to an agronomic dose of glyphosate in soil. Among the plant species evaluated, Lotus corniculatus was selected as a candidate for being able to tolerate exposure to 5.0 mg Kg-1 of glyphosate via the root route and 700 g ha-1 via the foliar route. A culture collection of pure strains was obtained and the physicochemical characterization of the soils and the study of their microbial communities were carried out. It was observed that, when explaining the differences among microbial communities, the rhizospheric effect prevails over the edaphic characteristics or chronic applications with glyphosate. Almost all the microorganisms isolated belong to the class Alphaproteobacteria, and met the requirements of: tolerating the maximum concentration of glyphosate reported in agronomic soils, using glyphosate as the only source of phosphorus, and possessing different capacities for promoting V plant growth, showing all the strains at least three positive results. The whole genome sequencing of two of the most promising strains, Ochrobactrum sp. P6BS-III and Rhizobium sp. P44RR-XXI was performed. The use of different methodologies of in silico genome-to-genome comparison was used to obtain complementary information regarding the genome structure of Rhizobium sp. P44RR-XXIV. At the same time, Ochrobactrum sp. P6BS-III genome contributed with a large number of unique genes to the genus, many of them having no asigned function. Finally, plant-microorganism interaction studies were carried out using glyphosate tolerant and degrading bacteria strains together with L. corniculatus, which consisted of inoculation tests on vertical agar plates, imaging studies using different microscopy methods and a microcosm assay. In vertical agar plates assays, strains showed a high growth when inoculated with the plant, without causing any sign of damage on them. The microscopy images obtained showed the different colonization patterns of Ochrobactrum sp. P6BS-III and Rhizobium sp. P44RR-XXIV in roots. The microcosm assay revealed that L. corniculatus inoculated with Ochrobactrum sp. P6BS-III achieved the degradation of almost all the 5 mg Kg-1 of glyphosate in soil after 20 days post application, considering this time adequate for the proposed remediation system