Test hipoosmótico combinado a la tinción de Coomassie blue en espermatozoides de llama

Abstract

La integridad de las membranas plasmática y acrosomal es de gran importancia para determinar la capacidad fertilizante de los espermatozoides. Los objetivos de este trabajo fueron: 1) evaluar la funcionalidad de la membrana plasmática a través del tiempo mediante el test hipoosmótico (HOS) y 2) combinar la técnica de HOS con la tinción de Coomassie Blue (CB) para evaluar simultáneamente la funcionalidad de membrana y la integridad acrosomal en espermatozoides de semen fresco de llama. Se obtuvieron 12 eyaculados de 6 machos mediante electroeyaculación bajo anestesia general. Se realizó el test de endósmosis con y sin fijación en paraformadehído y evaluando a diferentes tiempos de conservación (0 hs sin fijar y 0, 2, 4 y 24 hs fijado). Una alícuota de la muestra fijada se procesó y se tiñó con CB. No se observaron diferencias significativas (p>0,05) en el porcentaje de espermatozoides con membranas funcionales al comparar la muestra no fijada y las muestras preservadas durante diferentes tiempos en la solución de fijación. Tampoco se observaron diferencias significativas (p>0,05) en el porcentaje de endósmosis en las muestras en las que sólo se realizó HOS y en las que se realizó HOS en combinación con CB. Es posible diferir el momento de la evaluación de la funcionalidad de membrana de los espermatozoides de llama mediante la técnica de HOS de la colecta del semen. La técnica dual (HOS + CB) permite evaluar en forma simultánea la funcionalidad de las membranas e integridad acrosomal en espermatozoides de semen fresco de llama, facilitando el trabajo a campo.To stablish sperm fertilization capacity membrane integrity and functionality are important characteristics to determine. The objectives of the present study were: 1) to evaluate the functionality of the plasma membrane over time by the hypoosmotic test (HOS) and 2) combined the HOS test with Coomassie Blue (CB) staining to simultaneously evaluate the functionality of membrane and acrosomal integrity in raw llama sperm. A total of 12 ejaculates from 6 adult llama males were collected using electroejaculation under general anesthesia. Hypoosmotic swelling test was performed with and without fixation in paraformaldehyde and the samples were evaluated over time (0 h without fixation and 0; 2; 4; and 24 h when fixed). To perform the CB stain one aliquot of the fixed samples was used. No significant differences (p>0.05) were observed in the percentage of sperm with membrane function when comparing fixed samples analyzed over time versus the samples not fixed. Also, no statistical differences (p>0.05) were observed on membrane functionality between the two protocols used; HOS test versus HOS combined with the CB stain. It is possible to differ the moment of the evaluation of the membrane functionality of llama spermatozoa using the HOS technique from the semen collection. The use of the dual technique (HOS + CB) allow the evaluation of sperm membrane function and acrosome status in raw llama semen with only one technique that can be applied on the field.