Desarrollo de estrategias analíticas basadas en técnicas cromatográficas y modelado quimiométrico para la determinación de ácido retinoico y principios activos de uso veterinario en muestras de interés biológico

Abstract

El Capítulo 1 contiene el desarrollo de métodos para la determinación de ácido retinoico en plasma. El ácido retinoico, retinoide proveniente de la vitamina A, es responsable de varios pasos en los procesos de diferenciación celular y crecimiento. En la sección “Método 1: Separación cromatográfica de ácido retinoico y sus isómeros”, se describe el desarrollo analítico necesario para obtener la separación cromatográfica del ácido retinoico y sus isómeros con detección UV-Vis. La optimización se llevó a cabo mediante un diseño de experimentos. El método se validó completamente, analizándose los parámetros selectividad, límites de cuantificación y detección, efecto matriz, rango lineal y de trabajo, repetitividad y precisión intermedia, recuperación y robustez. Luego del análisis de los datos se obtuvieron resultados aceptables, concluyéndose, por un lado, la falta de efecto matriz en el rango de trabajo y, por el otro, la bondad del método en términos de precisión y recuperación. A su vez, se profundizó en la determinación de los límites de detección, analizándose la factibilidad de utilizar una variedad de técnicas aceptadas por diferentes normativas. El método desarrollado y validado permitió el análisis de ácido retinoico en muestras de plasma de Leptodactylus chaquensis. Para el estudio los individuos se recolectaron en dos zonas, una zona de referencia y un campo de arroz. Como conclusión, las diferencias en las concentraciones de ácido retinoico y 13-cis-ácido retinoico, y la falta de diferencias entre los valores de retinol, permite suponer que los contaminantes a los que los anfibios estuvieron expuestos afectan la vía del ácido retinoico en un paso posterior a la conversión a retinol. Estas diferencias hacen necesario el monitoreo constante de las poblaciones, con el fin de estudiar el mecanismo por el cual los contaminantes influyen en la vía de señalización de los retinoides. Por su parte, en la sección “Método 2: Análisis quimiométrico de ácido retinoico y sus isómeros”, se utilizó el algoritmo MCR-ALS con el objetivo de determinar retinoides a partir de datos obtenidos cuando hay separaciones parciales entre los componentes participantes. Para el análisis se construyó la matriz aumentada en modo temporal, a partir de matrices con dimensiones 201 × 102 (modo temporal y espectral, respectivamente), correspondientes al corte en tiempos 2.8 y 4.6 minutos y longitudes de onda 240 y 442 nm. En este apartado se determinaron los compuestos 9,13- di-cis-ácido retinoico, 13-cis-ácido retinoico, 9-cis-ácido retinoico y ácido retinoico. Como restricciones se utilizaron no negatividad en concentración y espectros, unimodalidad en concentración, y normalización de espectros, con buenos valores de porcentaje de varianza y falta de ajuste. Por su parte, luego de la validación del método se calcularon las concentraciones de estos retinoides en pacientes en tratamiento con Isotretinoína, medicamento empleado para el control del acné severo. Del análisis de 25 pacientes, se observó que las especies predominantes corresponden, en orden de magnitud, a 13-cis-ácido retinoico, ácido retinoico, 9,13-di-cis-ácido retinoico y 9-cis-ácido retinoico. Los resultados obtenidos resultan de suma importancia en el monitoreo de los retinoides en pacientes con el fin de realizar tratamientos específicos, ajustando las concentraciones administradas, y logrando de este modo disminuir sus problemas teratogénicos. Al final del presente capítulo se realizó una comparación entre los métodos mediante la aplicación del test EJCR. Como conclusión, las herramientas quimiométricas permiten determinar en forma simultánea los componentes de la matriz y los analitos de interés, pudiéndose cuantificar los compuestos retinol y 9-cis-ácido retinoico, los que coeluyen en el método separativo. Por esta razón, las ventajas del análisis quimiométrico hacen posible la determinación de los compuestos de interés, aún en presencia de componentes no calibrados. El Capítulo 2 muestra el desarrollo de métodos para la determinación de principios activos de uso veterinario presentes en matrices complejas como huevo y cama de pollo. El capítulo está organizado de manera de mostrar el avance en complejidad, desde el estudio fisicoquímico de los analitos de interés, la optimización de métodos de extracción y el desarrollo de un sistema cromatográfico para la determinación de multianalitos, con posterior utilización de herramientas quimiométricas. En la sección “Determinación de constantes de acidez mediante EC-DAD”, se analizó la factibilidad del uso de dos estrategias para determinar valores de pKa : la construcción de curvas de movilidad electroforética versus pH y el análisis de matrices UV-Vis mediante MCR-ALS. Las dos metodologías resultaron acordes para la obtención de valores de pKa aparente del componente de nicarbazina HDP. Por su parte, MCR-ALS brinda la ventaja de obtener las diferentes especies de los analitos presentes durante las corridas electroforéticas. En la sección “Determinación de principios activos en huevo monitorizada mediante CLAR con DAD y FSFD” se presenta el desarrollo de dos estrategias de microextracción con el objetivo de analizar seis principios activos de uso veterinario en huevo. Para poder llevar a cabo la extracción, se analizaron diferentes diseños de experimentos, optimizándose los volúmenes de los solventes necesarios para un método de microextracción dispersiva líquido-líquido con solidificación de la gota del solvente asistido por aire y los volúmenes de solvente extractante y dispersivo de un método de microextracción dispersiva líquido-líquido. Posteriormente, se realizó un diseño para obtener los solventes necesarios para la resuspensión de los analitos. Para completar el estudio, se analizó la influencia que ejercen el sistema de extracción y la matriz de la muestra. Mediante los resultados obtenidos fue posible concluir que las diferencias fisicoquímicas de los analitos determinan la factibilidad del uso de un método de extracción sobre el otro. Se concluyó que resulta de suma importancia el estudio del efecto que ejerce el sistema de extracción sobre las recuperaciones de los analitos; efecto que es independiente de la matriz en estudio. Además, el uso rutinario de estos métodos permite reducir los volúmenes de solventes involucrados en el proceso. Por último, en la sección “Determinación de principios activos en cama de pollo mediante CLAR con DAD y FSFD”, se realizó el desarrollo completo del sistema cromatográfico, estudiando, en una primera instancia, la influencia que ejerce el pH sobre los tiempos de retención de los 21 analitos en estudio. Posteriormente se analizaron los factores solvente orgánico, gradiente de elución, flujo y temperatura del sistema, con el objetivo de obtener un método cromatográfico que posea la mayor resolución entre los analitos. En este punto, el objetivo principal fue separar temporalmente los analitos que comparten características espectrales. Por su parte, mediante el uso de diseños de experimentos se optimizó el método de extracción, tanto en los porcentajes de solvente necesario como en el tiempo total de extracción. En esta sección, debido a la complejidad de la matriz, la validación se realizó en matriz adicionada, por lo tanto, para la obtención de los analitos de interés, se procedió al análisis utilizando herramientas quimiométricas. Entonces, primero se realizó una corrección de línea de base, disminuyéndose considerablemente la complejidad de los datos, con la posterior separación de las matrices en regiones, para finalizar el análisis mediante MCR-ALS. El modelado de los datos por MCR-ALS proporcionó resultados cualitativos y cuantitativos satisfactorios, lo que apoyó su aplicación a la resolución de picos altamente superpuestos en presencia de compuestos de la matriz. Durante la validación del método se obtuvieron buenos rangos lineales y excelentes recuperaciones y precisiones. El método se aplicó con éxito a la determinación de principios activos en muestras de diferentes granjas comerciales. Durante el análisis de estas muestras se confirmó la presencia de una variedad de principios activos, observándose la necesidad de realizar un monitoreo constante en los sistemas productivos aviares, con el fin de mantener la inocuidad de los sistemas aledaños.

The Chapter one includes the development of methods to determine retinoic acid in plasma. The retinoid acid, a derivative of vitamin A, is responsible for several steps in cell differentiation and growth. In the section “Method 1: Chromatographic separation of retinoic acid and its isomers”, the analytical development necessary to obtain the chromatographic separation of retinoic acid and its isomers using a liquid chromatograph coupled to a UV-Vis array detector was described. The optimization of the chromatographic system was carried out using experimental design. The method was fully validated through the analysis of the parameters selectivity, limits of quantification and detection, matrix effect, linear and working range, repetitively and intermediate accuracy, recovery and robustness. After the analysis, acceptable results were obtained, concluding about lack of matrix effect and goodness of the method in terms of precision and recovery. At the same time, the determination of detection limits was deepened by analyzing the feasibility of using a variety of techniques accepted by different regulations. This method allowed the study of retinoic acid in plasma of Leptodactylus chaquensis. The individuals were collected from two zones, a reference zone and a rice field. In conclusion, the differences in the concentration of 13-cis-retionic acid and retinoic acid, but the lack of differences in retinol between the zones, suggest that the contaminants affect a part of the retinoic acid pathway following the conversion to retinol. These differences require the constant monitoring of the populations, in order to study the mechanism by which the contaminants influence the signaling pathway of retinoic acid. On the other hand, the use of MCR-ALS was analyzed in the section “Method 2: Chemometric analysis of retinoic acid and its isomers” in order to deal with the determination of compounds with partial separation between themselves and the matrix compounds. In order to perform the analysis, the augmented matrix was constructed in the temporal mode, from matrices with dimensions 201 × 102 (temporal and spectra, respectively), corresponding to the restriction at 2.8 to 4.6 minutes and 240 to 420 nm wavelengths, with the aim of analyzing the presence of 9,13-di-cis-retinoic acid, 13-cisretinoic acid, 9-cis-retinoic acid, retinoic acid. Non-negativity in concentration and spectra, unimodality in concentration, and normalization of spectra were used as restriction, and good values of percentage of variance and lack of fit were obtained. After the validation of the method, the concentration of retinoids in patients treated with Isotretinoin, a medication used for the control of severe acne, was continued. From the analysis of 25 patients, it was observed that the predominant species correspond, in order of magnitude, to 13-cis-retinoic acid, retinoic acid, 9,13-dicis-retinoic acid and 9-cis-retinoic acid. The result were of great importance in the monitoring of the plasma concentrations of patients undergoing treatment, in order to perform specific treatments, adjusting the concentrations administered, and thus reducing the teratogenic problems. At the end of the present chapter a comparison between the methods through the study of the EJCR test was made. As a conclusion, when using the chemometric tools, the method is able to simultaneously determine the components of the matrix and the analytes of interest, being able to quantify the retinol and 9-cis retinoic acid compounds, retinoids that co-elute in the separative method. For this reason, the advantages of the chemometric analysis make it possible to determine the compounds of interest, even in the presence of non-calibrated components. Chapter two emphasizes the developed of methods for the determination of veterinary active ingredients, with the aim of their implementation in complex matrix such as egg and poultry litter. The information included in the chapter goes from the simplest to the most complicated; from the study of the physicochemical characteristic of the analytes, the development of the extraction method and finally the development of a chromatographic method for the multi analytes determination, using the advantages of the chemometric tools. In the “Determination of acid constants through EC-DAD”section, the feasibility of two strategies to determine pKa values were analyzed: the construction of electrophoretic mobility versus pH curves and the analysis of UV-Vis matrices using MCR-ALS. As a result, the two methodologies were consistent to obtain apparent pKa values of the HDP nicarbazina component. Besides, the advantage of using MCR-ALS is to obtain the different species present during the electrophoresis runs. In the section “Determination of active ingredients in eggs monitored through CLAR with DAD and FSFD” the development of two strategies of micro-extraction with the objective of analyzing six active principles of veterinary use in egg is presented. In this sense, in order to carry out the extraction, different designs of experiment were analyzed, by means of which the volumes of solvents necessary for the air assisted-dispersive liquid-liquid micro-extraction based on solidification of floating organic drop method, and the volume of extractante and dispersive solvent for the dispersive liquid-liquid micro-extraction method with the subsequent development of a design to obtain the solvents necessary for the re-suspension of the analytes were performed. Hence, to complete the study, the influence produced by the extraction system and by the matrix on the extraction of the analytes was individually analyzed. The result showed that the physical differences of the analytes determine the feasibility of the use of one method of extraction over the other. As conclusion, it is extremely important to study the effect of the extraction system on analyte recoveries, which is independent of the matrix under study. Further, the routine use of these methods allows reducing the volume of solvents involved in the process. Eventually, in the section “Determination of active ingredients in poultry litter through CLAR with DAD and FSFD”, the complete development of the chromatographic system was carried out, studying firstly the influence of the pH on the retention times of the twenty-one analytes under study. Subsequently the organic solvent, elution gradient, flow and temperature of the system were analyzed with the objective of obtaining a chromatographic method that keeps the highest resolution among the analytes. At this point, the main objective was to temporarily separate the analytes that share spectral characteristics. On the other hand, through the use of experimental designs, the extraction method was optimized, in the required solvent percentages and in the total extraction time. In this section, due to the complexity of the matrix, the validation was performed in an added matrix, so that, to obtain the analytes of interest, the analysis was performed using chemometric tools. Thereby, a baseline correction was performed to considerably reduce the complexity of the data. Then the arrays were separated into regions and a last step of analysis by MCR-ALS. The modeling of the data by MCR-ALS provided satisfactory qualitative and quantitative results, which supported its application to the resolution of highly superimposed peaks in the presence of matrix compounds. Therefore, during the validation of the method good linear ranges and excellent recoveries and precisions were obtained. The method was successfully applied to the determination of active principles in samples from different commercial farms. During the analysis of these samples the presence of a variety of active principles was confirmed, observing the need for a constant monitoring in the avian productive systems, in order to maintain the safety of the surrounding systems.