Elucidación de la auto-organización de la proteína gliadina y su péptido 33-mer in vitro

Abstract

La Gliadina es una proteína presente en el trigo, avena, centeno y cebada, que no es completamente degradada durante el proceso de la digestión, produciendo varios péptidos, entre ellos el 33-mer. Este péptido se conoce por ser el principal inmuno-modulador de la patología celíaca, provocando un desbalance entre la tolerancia y auto-inmunidad. En esta tesis se presenta el estudio estructural y la elucidación de la auto-organización de la proteína gliadina y de su péptido 33-mer en medio acuoso y sobre superficies, mimetizando condiciones fisiológicas in vitro. En primer lugar, se determinó que la proteína gliadina se auto-organiza espontáneamente formando agregados solubles a pH 3.0. Cuando se cambió el pH a 7.0, se observó una separación de fases, con disminución de la concentración y cambio en la composición aunque permanecieron ciertas nano-estructuras y agregados amorfos en solución. Si bien no se observaron modificaciones en la estructura secundaria a ambos pHs, se detectó una exposición diferencial de los residuos aromáticos como Tirosina y Triptófano, lo cual puede deberse a un cambio en la estructura terciaria. Por técnicas bioinformáticas, se determinaron probables sitios hidrofóbicos, residuos expuestos al solvente y regiones con capacidad de agregarse, los cuales podrían explicar los hallazgos experimentales observados. Por otro lado, el fluoróforo Rojo Nilo presentó una unión en el orden micromolar solo a pH 3.0, lo cual sugiere la presencia de sitios hidrofóbicos accesibles en los agregados solo a este pH. Estos resultaron sugieren que a pH 3.0 el sistema se organiza en nano- estructuras tipo micelares, mientras que a pH 7.0, las estructuras presentaron una disminución de la carga neta de la superficie (desde + 13 a pH 3.0, a + 4 mV a pH 7), llevando a la formación de nano- partículas coloidales que no interactúan con el Rojo Nilo. En segundo lugar, se evaluaron las características estructurales del péptido 33-mer mediante dicroísmo circular y espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier -reflectancia total atenuada, se ha demostrado que el 33-mer se encuentra en un equilibrio conformacional random coil/PPII y PPII/β paralela, dependiente de la concentración. Mediante dinámica molecular y distribución de cargas parciales fue posible observar que el péptido se comporta como una molécula anfifílica y es capaz de asociarse formando al menos un dímero estable. En agua a pH 7.0 se observaron oligómeros manométricos y estructuras fibrilares por microscopia electrónica. La presencia de oligómeros en solución del péptido 33-mer fue confirmado mediante anisotropía y fluorescencia resuelta en el tiempo del residuo Tirosina y DLS-Correlación 3D, detectando que 33-mer es un sistema polidisperso dinámico con partículas de tamaños entre los nano y micrómetros en todo el rango de concentraciones analizado (125-610 μM). La microscopia de fuerza atómica del péptido 33-mer en función de la concentración sobre mica confirmó la capacidad de 33-mer de formar nano y micro-estructuras con diferentes morfologías. Se observó a bajas concentraciones clusters de nanoesferas. A concentraciones intermedias oligómeros esféricos asociándose en arreglos lineales, anulares y estructuras similares a placas. A altas concentraciones, se observaron filamentos y placas rodeadas por nanoesferas, con una disposición del tipo fractal. Este tipo de organización se produce mediante un mecanismo de Agregación Limitada por la Difusión. Por otro lado, se evaluaron los oligómeros del péptido 33-mer sobre dos superficies hidrofóbicas miméticas al intestino, como el HOPG y el dióxido de silicio. En el HOPG se detectaron estructuras de morfología similar a las obtenidas en mica. En la superficie de dióxido de silicio, el auto-ensamblado del 33-mer fue dinámico y dependiente de las condiciones de preparación de la muestra, obteniéndose agregados a través de un mecanismo de percolación. Finalmente, la morfología de las nano-estructuras presentes a 600 μM se resolvió mejor utilizando un microscopio de ion Helio, detectando además de las estructuras mencionadas anteriormente, de nano-cilindros, los cuales se proponen como intermediarios en la formación de las fibras detectadas. La capacidad de formación de nano-estructuras de variadas morfologías de la gliadina y de su péptido 33-mer in vitro y el hecho que estas posean una estructura secundaria característica podría ser un conocimiento fundamental en el estudio de las patologías relacionadas con el gluten

Gliadin is a protein present in wheat, rye, and barley that undergoes an incomplete degradation during digestion, producing several peptides, including 33-mer. This peptide is known to be the most important immunomodulator peptide of celiac disease, producing an imbalance between tolerance and auto-immunity. In this PhD Thesis it is presented a structural and auto-organization elucidation of gliadin and its 33-mer peptide in aqueous medium and on surfaces, in physiological conditions in vitro. Firstly, it was determined that gliadin self-assemble spontaneously at pH 3.0 forming spherical aggregates. When the pH was changed to 7.0 a phase separation, concentration diminution and a change on the composition was observed. However, soluble amorphous aggregates remained in solution. Although no difference in the secondary structure at both pHs were detected, differential exposition of Tyrosine and Tryptophan was observed, which could be caused by a tertiary structure change. By applying bioinformatics' tools, possible hydrophobic sites, residues exposed to the solvent and regions with capability to auto-aggregate were evaluated, they could explain the experimental results observed. In the other hand, Nile Red only bound to gliadin nanostructures in the micromolar order at pH 3.0, suggesting that hydrophobic sites were accessible at this pH. These results indicated that a pH 3.0, the system auto-organized as micelar nano-structures, meanwhile at pH 7.0 the nano-structures presented a diminution of the surface charge (from + 13 at pH 3.0 to + 4 mV a pH 7), inducing the formation of colloidal nano-particles that did not interact with Nile Red. Secondly, the structural characteristics of 33-mer peptide were studied by Circular Dichroism and Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infra Red Spectroscopy, showed a conformational equilibrium between coil/PPII y PPII/β paralell structures depending on concentration. By Molecular Dynamic Simulation and Partial Charge Distribution, it was observed that the peptide was an amphiphilic molecule and it is capable of associate at least as a stable dimmer. By Electron Microcopy the tendency to self-assemble of the peptide was detected. In water at pH 7.0, oligomers and fibrilar structures were observed. By Time Resolved Fluorescence of Tyrosine, Dynamic Light Scattering-Correlation 3D in aqueous medium have determined that 33-mer peptide is a dynamic polydisperse system with particles of size between nano-micrometers in the range of concentration analyzed (125-610 μM). Studies done by Atomic Force Microscopy of 33-mer peptide depending on concentration on mica demonstrated that it could form nano and micro structures with different morphologies. It was observed at low concentration clusters of nano-spheres. At Intermediate concentrations spheric oligomers, annular and sheet like structures were observed. A high concentration, filaments and sheets surrounded by nanospheres, with a fractal disposition were detected. This kind of organization was produced by a Diffusion Limited Aggregation. In the other hand, the auto-organization of 33-mer peptide on two hydrophobic surfaces that are mimetic to the gut surface as HOPG and Silicon dioxide were evaluated. On HOPG similar structures as the ones detected on mica were observed. On Silicon Dioxide the auto-organization of 33-mer was dynamic and dependent on the conditions in which samples were prepared, detecting aggregates that were formed by a percolation mechanism. Finally, the morphology of the aggregates at 600 μM where observed using a Helium Microscope, detecting the formation of nano-rods, which are proposed as the intermediaries in the Fibril formation phenomena. Finally, the morphology of the aggregates at 600 μM where better resolved by an ion Helium Microscope, detecting the formation of nano-rods, which are proposed as the intermediaries in the fibril formation phenomena. .The capability of Gliadin and its 33-mer peptide to generate nano-structures of different morphologies in vitro and the fact that they have a characteristic secondary structure may be a fundamental knowledge in the study of gluten related diseases.