Inmovilización de peroxidasasobre un electrodo de carbono modificado con óxido de grafenoreducido y nanopartículas de oro

Abstract

En este trabajo se describe la inmovilización de la enzima peroxidasa de rábano picante (PRP)1 y la detección de peróxido de hidrógeno (H2O2) sobre la superficie de un electrodo de carbono vítreo (ECV) modificado por electrodeposición de óxido de grafeno reducido (OGR) y nanopartículas de oro (NPsO). La síntesis del óxido de grafeno (OG) se realizó según el Método de Hummers modificado2 y por deposición, se colocaron 10 μL de la suspensión sobre la superficie del ECV dejándolo secar bajo lámpara. Posteriormente, se procedió a la reducción del OG por voltamperometría cíclica aplicando un rango de potencial de 0 a -1500 mV (20 ciclos) a una velocidad de barrido de 100 mV s-1 en una solución 0,5 mol L-1 de NaNO3 a pH 4,00 en buffer acetato. Se procedió a electrodepositar las NPsO sobre el electrodo previamente modificado en una solución de HAuCl4 0,6 mmol L-1 en medio H2SO4 0,05 mol L-1 aplicándose un potencial fijo de -200 mV durante 60 s. Para corroborar la modificación del electrodo, se testeó en una solución de [Fe(CN)6]-4/-3 1 mmol L-1 con KCl 0,1 mol L-1 como electrolito soporte, generándose una señal mayor respecto del electrodo ECV/OGR. Para la inmovilización de la enzima, el electrodo ECV/OGR/NPsO se sumergió e incubó en una solución de ácido lipóico (ALP) 0.04 mol L-1 en EtOH/H2O 75/25 v/v durante 4 h a temperatura ambiente. Seguidamente, se realizaron lavados con buffer 0,01 mol L-1 PBS pH 7,20 y se secó con gas N2. En esta etapa, el ALP se unió covalentemente a los átomos de oro de la superficie del electrodo por medio de los grupos tioles formando una monocapa. Seguidamente, el electrodo modificado se puso en contacto con una solución de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida hidrocloruro (EDC) 0,04 mol L-1 en buffer PBS y se incubó por 3 h a temperatura ambiente. Luego, se lavó con buffer PBS y se almacenó hasta su utilización. En esta fase se produce la activación de los grupos carboxilos del ALP para su posterior unión covalente a los grupos amino de la enzima. En el último paso, el electrodo modificado se sumergió durante 15 h a 4°C en una solución de PRP 0,25 mg mL-1 en buffer PBS y antes de ser utilizado se lavó con el mismo buffer. Luego el electrodo ECV/OGR/NPsO-PRP (trabajo) se introdujo en una celda electroquímica compuesta por un electrodo de Ag/AgCl en NaCl 3 mol L-1(referencia) y un contraelectrodo de Pt (auxiliar) de gran área. La cual contenía una solución de 5 mL de buffer citrato, 0,01 mol L-1, pH 5,00 en presencia de 1 mmol L-1 catecol (QH2) y de adiciones sucesivas de peróxido de hidrógeno (H2O2). La enzima PRP catalizó la reducción de H2O2 a H2O con la consecuente oxidación del mediador electroquímico QH2 a o-benzoquinona (Q). La posterior reducción electroquímica de Q a QH2 fue detectada sobre la superficie del electrodo de trabajo a -100 mV vs Ag/AgCl en NaCl 3 mol L-1. La intensidad de corriente generada como respuesta analítica fue directamente proporcional a la actividad enzimática y consecuentemente a la concentración de H2O2 adicionada al sistema.