Nuevos péptidos con actividad antimicrobiana identificados en la piel de la rana patagónica Pleurodema somuncurense: Caracterización de su mecanismo de acción

Abstract

El potencial de los péptidos antimicrobianos (PAMs) como alternativa a las terapias convencionales es bien reconocido. El conocimiento de las propiedades biológicas y biofísicas de los PAMs es, por lo tanto, clave para comprender su modo de acción. El objetivo de este trabajo fue la identificación de PAMs de la piel de la rana patagónica Pleurodema somuncurense y la caracterización de su mecanismo de acción mediante el estudio de la interacción y actividad permeabilizante con membranas modelo. Se extrajo el ARN total a partir de la piel de un ejemplar de P. somuncurense y se obtuvo el ADNc utilizando primers específicos. Los productos de PCR se purificaron, transfectaron y clonaron en células competentes. Los plásmidos resultantes se purificaron y se evaluaron los tamaños de los insertos, seleccionando 11 para ser secuenciados. Se dedujo la secuencia aminoacídica de los prepro-péptidos identificados. Mediante el análisis in-sílico se seleccionaron 8 péptidos maduros, los cuales fueronsintetizados por química F-moc y purificados por RP-HPLC. Se evaluó la actividad antimicrobiana contra cepas Escherichia coli y Staphyloccocus aureus ATCC. Actualmente se está analizando la capacidad de permeabilizar membranas de extracto lipídico total de E. coli y de lisarlas mediante el estudio de laliberación de carboxifluoresceína (CF) atrapada en el interior de liposomas unilamelares grandes (LUVs) y permeación de vesículas unilamelares gigantes (GUVs). La formación de agregados de vesículas seanalizó por dispersión dinámica de luz (DLS) y nefelometría.De los 8 péptidos estudiados, dos inhibieron el crecimiento de E. coli (CIM=600-500 µg/mL) y uno inhibió tanto el crecimiento de E.coli (CIM=250-125 µg/ml) como el de S. aureus (CIM=500-250 µg/mL). Este último fue el que produjo mayor aumento de la señal de fluorescencia de CF y el análisis de la dispersiónmostró un gran aumento de la intensidad más allá de los 250 µg/mL, comparado con los otros péptidos analizados de menor CIM. Estos resultados preliminares indicarían que no hay una correlación directa entre la ruptura de bicapas lipídicas y la actividad antimicrobiana.A partir de los análisis del comportamiento de éstos péptidos frente a sistemas modelos y del análisis de sus secuencias nos proponemos caracterizar el Mecanismo de acción de los mismos a fin de evaluar posibles modificaciones químicas que mejoren su performance.