Síntesis de péptidos antihipertensivos de interés industrial, utilizando nuevas fitoproteasas autóctonas inmovilizadas

Abstract

Los péptidos son polímeros que contienen entre dos y pocas docenas de aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo de uno de ellos y el grupo α-amino del siguiente, con límite de masa molecular de 6.000 Da y de relevancia para el cuidado de la salud y la nutrición. El mercado mundial de péptidos está orientado principalmente a la industria farmacéutica, y se estima que alcanzará US $ 23.70 millones en 2020, lo que significa una tasa de crecimiento anual compuesta de 2,8 % para el período 2014 a 2020. En contraste, la producción de péptidos bioactivos para uso alimenticio (nutracéuticos, alimentos funcionales y conservantes) es escasa, aunque es un ámbito de intensa investigación. El objetivo general de este trabajo es aplicar proteasas pre-purificadas de Asclepias curassavica L. (Asclepiadaceae), una planta superior que crece en Argentina, en forma soluble o inmovilizada y en sistemas acuoso-orgánicos, como un nuevo catalizador de la síntesis de péptidos con potencial actividad antihipertensiva in vitro.La originalidad de este trabajo está centrada tanto en la síntesis de péptidos con potencial actividad antihipertensiva in vitro utilizando fitoproteasas autóctonas, como en su potencial aplicación en la formulación de alimentos funcionales. Para seleccionar los medios de reacción más promisorios de las síntesis de péptidos, se estudió el efecto de los solventes orgánicos sobre la actividad proteolítica y la estabilidad operacional de asclepaína en sistemas homogéneos y macroheterogéneos, utilizando la enzima libre e inmovilizada en diferentes soportes. Los medios de reacción más promisorios fueron el sistema homogéneo formado por metanol 30 % v/v en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8, y el sistema macroheterogéneo formado por 50 % v/v de acetato de etilo en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8. En ellos, asclepaína expresó tiempos de vida media de 7,21 y 11,07 h, respectivamente.El efecto de los de los solventes orgánicos sobre la estructura secundaria de asclepaína cI se estudió por FTIR y se evaluó mediante el coeficiente de similitud espectral (r), tomando como referencia la estructura secundaria obtenida en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8. Asclepaína cI no mostró diferencias significativas de r en buffer, metanol 30 % v/v o DMS 70 % v/v, en concordancia con el hecho de que en dichos medios miscibles se obtuvieron los mayores tiempos de vida media de asclepaína. Por el contrario, asclepaína cI en los sistemas bifásicos formados por 1-octanol 30 % v/v, hexano 50 % v/v, acetato de etilo 50 % v/v en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8, presentó diferencias espectrales significativas. Sin embargo, y a pesar de su menor similitud, asclepaína cI mostró mayor estabilidad en los sistemas bifásicos que en los sistemas miscibles seleccionados. La selección del donador de acilo (sustrato limitante) para las reacciones de síntesis se realizó mediante un estudio de las preferencias de asclepaína por diversos derivados aminoacídicos sintéticos, en los medios de reacción previamente seleccionados.Asclepaína en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8 y en metanol 30 % v/v exhibió amplia preferencia por los derivados aminoacídicos no polares, especialmente por Val; mientras que en acetato de etilo 50 % v/v mostró preferencia por los aminoácidos polares, especialmente por Gln y Tyr.A partir de la base de datos BIOPEP (2012) y de bibliografía, tomando como base las preferencias de asclepaína, se seleccionaron los péptidos Val-Gly (VG), Gln-Gly (QG) y Tyr-Gln (YQ), con actividad antihipertensiva in vitro con el objeto de sintetizarlos por vía enzimática. Se obtuvieron con éxito los péptidos Z-VG, análogo de VG, Z-QG, análogo de QG y Z-YQQ, análogo de YQ. El péptido Z-VG fue sintetizado por vía enzimática bajo control cinético y termodinámico, en metanol al 30 % v/v en buffer Tris-HCl 0,1M pH 8, utilizando asclepaína en forma soluble e inmovilizada. El rendimiento en producto de la reacción de síntesis bajo control cinético y termodinámico, utilizando asclepaína soluble, fue de 19 % y 13,5 %; pero se logró una maximización de 95 % de rendimiento empleando asclepaína inmovilizada en OGS bajo control cinético. El péptido Z-QG fue obtenido mediante síntesis bajo control cinética y no así bajo control termodinámico; el rendimiento máximo alcanzado fue de 76,43 %.El péptido Z-YQQ fue sintetizado por vía enzimática bajo control cinético en acetato de etilo 50 % (v/v) y buffer Tris-HCl 0,1M (pH 8), con un rendimiento de 100 % utilizando asclepaína soluble como catalizador.La actividad antihipertensiva de los péptidos Z-YQQ y Z-VG se evaluó como actividad inhibitoria de ECA en ensayos in vitro. El péptido de síntesis enzimática Z-YQQ-OH mostró un porcentaje de inhibición 35,5 % mayor al expresado por el péptido modelo YQ (Shamloo y col., 2015). Por el contrario, la actividad antihipertensiva del péptido Z-VG fue 37,3 % inferior a la del péptido análogo VG (Cheung y col., 1980). No obstante, en ambos casos los valores de IC50 obtenidos son notablemente mayores que el valor correspondiente al del inhibidor comercial captopril (IC50 de 0,21 x 10-4 mM), dicha diferencia puede deberse a que no existe un método estandarizado para medir la actividad antihipertensiva in vitro como actividad inhibitoria de ECA; por lo que éstos valores serán corroborados por una nueva metodología.Los resultados del párrafo anterior demuestran que Z-YQQ y Z-VG son promisorios agentes antihipertensivos, el primero en mayor medida. Por ello fue seleccionado para realizar estudios de toxicidad, estabilidad y otras actividades biológicas del mismo. Al evaluar la actividad antimicrobiana de Z-YQQ en un cultivo batch a escala de laboratorio frente a una cepa Gram positiva (S. aureus ATCC 25923) y frente a una cepa Gram negativa (E. coli ATCC 25922) no se observó inhibición del crecimiento microbiano.Por otra parte, se determinó la actividad anticoagulante del péptido Z-YQQ mediante Wiener Lab Test. El péptido sintetizado por vía enzimática Z-YQQ actuó sobre la vía general y sobre la vía extrínseca de la cascada de coagulación sanguínea, aumentando el tiempo de coagulación y retrasando el tiempo de polimerización de fibrinógeno a fibrina y la formación del coágulo, de manera similar a heparina. Dichos resultados pusieron de manifiesto su potencial, no solo como agente antihipertensivo, sino también como agente anticoagulante. Además, se demostró que el péptido Z-YQQ retuvo el 82 % de su actividad anticoagulante durante 15 min en un pool de plasma humano de individuos sanos, demostrando la alta estabilidad del péptido sintetizado en el rango de tiempo estudiado.La toxicidad aguda del péptido Z-YQQ se determinó como porcentaje de viabilidad celular después de exponer, durante 4 h a 37 °C, la línea celular humana 293 FT a diferentes concentraciones del péptido mencionado. Se empleó el método estadístico Kruskall-Wallis ANOVA para evaluar las diferencias significativas en los valores de viabilidad celular y se determinó que Z-YQQ no fue citotóxico en ensayos in vitro a las concentraciones analizadas.En general, esta tesis doctoral aporta nuevas estrategias y productos de interés para la industria alimenticia y farmacéutica, que implican una expansión del mercado actual y la potencial transferencia de resultados al sector socio-productivo interesado en los mismos. Además, contribuye al aprovechamiento de los recursos naturales renovables autóctonos de nuestro país, como son las fuentes vegetales de enzimas proteolíticas que han sido escasamente exploradas y no poseen patentes que dificulten su explotación.