Optimización de la técnica de ADN ambiental para la detección del Huillín (Lontra provocax) en sistemas dulceacuícolas de la Patagonia Argentina

Abstract

El muestreo de ADN ambiental (ADNa) es un método no invasivo, novedoso, altamente sensible, ideal para detectar la presencia de especies vulnerables o en peligro de extinción. El ADNa representa también una solución para relevamientos extensivos en áreas remotas logísticamente desafiantes. El Huillín (Lontra provocax) es una especie emblemática y amenazada que habita sistemas acuáticos patagónicos cuya distribución en Patagonia Norte necesita ser actualizada. Con el fin de detectar esta especie en sus ambientes naturales, nos propusimos ajustar la técnica de muestreo de ADNa, en las fases de muestreo, extracción y amplificación de ADN, para su aplicación en sitios de presencia incierta de la especie. Se trabajó en 9 sistemas acuáticos (3 Ríos y 6 Lagos) de la Provincia de Neuquén de abundancia relativa conocida para la especie (alta-media-baja/nula) en base a literatura. En cada sistema se seleccionaron 3 puntos de muestreo separados por 10 km. En cada punto se colectó y filtró agua utilizando un sistema de filtrado manual y filtros de Nitrato de Celulosa con poros de 0,45 um. Los filtros se reservaron en buffer de preservación a temperatura ambiente y luego fueron refrigerados a -20°C hasta su procesamiento. Para la amplificación se desarrollaron dos pares de primers especie-específicos para obtener fragmentos de ADN mitocondrial de entre 70 y 150 pb y se midió el umbral de amplificación de cada uno con diluciones seriadas de concentración de ADN de Huillín extraído de tejido. Para la extracción de ADN se probó la eficiencia del método de fenol-cloroformo y kits comerciales para materia fecal y tejido (Zymo Research). Por otro lado, para evaluar la presencia de inhibidores de PCR en las muestras extraídas con los distintos métodos, se amplificaron distintas diluciones (1:10; 1:20) junto a un Control Interno (ADN de Huillín). En los puntos de muestreo se lograron filtrar entre 1Lt y hasta 2Lts de agua por muestra (con 4 réplicas) hasta la saturación del filtro. Por otro lado, con el método de fenol-cloroformo se obtuvo en promedio 10 veces más concentración de ADN por muestra que utilizando kits comerciales, e independientemente del método de extracción la muestra debió ser diluida 1:10 para obtener una amplificación positiva. Se logró amplificar el ADN extraído a partir de las muestras colectadas en tres puntos de uno de los sitios de abundancia alta validando la técnica de muestreo para la especie.