Estudio de la capacidad inmunomoduladora de dehidroepiandrosterona y sus metabolitos oxigenados sobre las respuestas Mycobacterium tuberculosis-específicas en el contexto de la coinfección con HIV-1

Abstract

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es el agente causal de la tuberculosis (TB), una enfermedad infecciosa que en la actualidad afecta a aproximadamente un tercio de la población mundial y constituye una de las 10 principales causas de mortalidad globalmente. El tipo de respuesta inmunológica que el individuo despliegue, determinará si la enfermedad progresa o si desarrolla una infección crónica controlada. En particular, la probabilidad de enfermar en una persona coinfectada con el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) es de 20 a 30 veces mayor que en la población general. La interacción entre Mtb y el HIV es sinérgica, facilitando cada uno la patogenicidad del otro.El tratamiento de la TB en personas coinfectadas con HIV y Mtb (HIV-TB) es desafiante y tiene una duración extensa, debido a falla del sistema inmune en proveer un soporte adecuado para la terapia. Mediante el estudio y la identificación de los factores que conllevan a la progresión de la enfermedad, se podrían descubrir terapias dirigidas al hospedador centradas en potenciar los componentes clave de los mecanismos efectores anti-micobacterianos, limitando la inflamación y el daño patológico. La presente tesis de doctorado tiene como objetivo principal el estudio del rol de la hormona dehidroepiandrosterona (DHEA) y sus metabolitos oxigenados androstenediol (AED), androstenetriol (AET) y 7-oxo-DHEA como moduladores de la respuesta inmune anti-tuberculosa en el contexto de la coinfección HIV-TB. Para llevar adelante este objetivo principal, el trabajo se dividió en dos objetivos específicos.En primer lugar, se determinó la concentración de estas hormonas en plasma y su posible relación con el estado clínico del paciente. Para ello se optimizó la síntesis de los compuestos en estudio y se desarrolló una metodología basada en cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS/MS) para la cuantificación. En segundo término, se estudió el efecto inmunomodulador de los compuestos mencionados sobre la respuesta antígeno-específica de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) provenientes de pacientes coinfectados, comparando su respuesta con donantes sanos (DS).Los resultados obtenidos respecto de la cuantificación de hormonas inmunomoduladoras mostraron niveles plasmáticos estadísticamente más altos de DHEA, AET y 7-oxo-DHEA en pacientes HIV-TB, cuando se compararon con los valores provenientes de muestras de DS. Además, las concentración de 7-oxo-DHEA correlacionó positivamente con el recuento absoluto de células T CD4+, con un mayor valor nadir de LT CD4+ y con la localización de la TB, ya que aquellos individuos que presentaban una infección restringida a los pulmones mostraron niveles más altos de 7-oxo-DHEA en comparación con el grupo de pacientes que presentaron TB diseminada.Por otra parte, se ensayó el efecto inmunomodulador de los compuestos, estimulando las CMSP de HIV-TB y DS con un antígeno Mtb (cepa H37rv, irradiada y muerta por calor) y estudiando la proliferación celular y la producción de citoquinas antígeno-específica. Interesantemente, 7-oxo-DHEA a su concentración más efectiva (1x10-6M) fue capaz de estimular la proliferación celular y modular una respuesta con un perfil de citoquinas de tipo Th1, al incrementar los niveles de IFN- y TNF-, sin suprimir la acción necesaria de IL-10 (regulación) e inhibiendo la secreción de IL-17A (inflamación). Para conocer si alguna de las hormonas en estudio era capaz de promover un perfil Th1 sobre el perfil regulatorio, se estudió la relación entre IFN-, IL-17A, TNF- e IL-10. El efecto ejercido por 7-oxo-DHEA se manifestó en un incremento significativo de los niveles de IFN- y TNF- por sobre los de IL-10 y de la relación IFN-/IL-17A en HIV-TB y DS, lo que sugiere que podría articular una respuesta inmunoprotectora en lugar de una patológica.En base a los prometedores resultados encontrados sobre el efecto de 7-oxo-DHEA, no descripto hasta el momento, y con el fin de profundizar el conocimiento en cuanto a función inmunomoduladora, se realizaron dos estudios adicionales. Primero, se infectaron líneas celulares de macrófagos humanos THP-1 y alveolares murinos MH-S con Mtb cepa H37Rv en presencia de la hormona. Se observó que los cultivos expuestos a 7-oxo-DHEA mostraron una mayor capacidad fagocítica y un aumento en el control del crecimiento bacteriano, acompañado de un perfil de citoquinas pro-inflamatorio. Por último, se realizó un ensayo pre-clínico con un modelo murino de tuberculosis pulmonar progresiva. Se infectaron ratones BALB/c con Mtb cepa H37Rv y se trataron con 7-oxo-DHEA (15, 50 o 200 g/día, 3 veces por semana) desde el día 60 post-infección. Los resultados mostraron que luego de un mes de tratamiento, la carga bacteriana en pulmón y bazo de ratones infectados se redujo de forma significativa.Los resultados de este trabajo de investigación en el marco de una tesis doctoral permiten concluir que 7-oxo-DHEA actúa como un potente compuesto inmunoprotector. Se propone que esta hormona podría utilizarse como un adyuvante de la terapia para mejorar el tratamiento de la TB, acortando los tiempos de tratamiento y mejorando la calidad de vida de los pacientes, particularmente aquellos inmunocomprometidos como los individuos HIV+.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the causative agent of tuberculosis (TB), an infectious disease that currently affects approximately one third of the world's population and it constitutes one of the top 10 causes of deaths worldwide. The type of individual's immune response will determine disease progression or its development into a chronic infection. Particularly, the risk of developing TB in human immunodeficiency virus (HIV)-coinfected patients is 20 to 30 times higher than those without HIV infection. The synergistic interplay between these two pathogens accelerates a decline in immunological functions. TB treatment in people coinfected with HIV and Mtb (HIV-TB) is challenging and it has a prolonged duration, mainly due to failure of the immune system to provide an adequate support for the therapy. Novel host-directed therapy could be discovered by studying and identifying factors that lead to disease progression. Thus, the aim of this PhD thesis work was to study the role of the hormone dehydroepiandrosterone (DHEA) and its oxygenated metabolites androstenediol (AED), androstenetriol (AET) and 7-oxo-DHEA as modulators of the anti-tuberculous immune response in the context of HIV-TB coinfection. To achieve the main objective, the work was divided into two specific purposes. First, plasma hormone concentrations were determined and related with the clinical status of the patient. To this end, the synthesis of the compounds studied was optimized, and a methodology based on high resolution liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was developed. Secondly, the immunomodulatory effect of the aforementioned compounds on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from co-infected patients was studied, comparing their response with healthy donors (HD). Regarding hormone´s quantitation, the results showed statistically higher plasma levels of DHEA, AET and 7-oxo-DHEA in HIV-TB patients, compared to samples from HD. In addition, 7-oxoDHEA plasma concentration positively correlated with the absolute CD4+ T cell count, with nadir CD4+ T cell count values and with TB localization, as those individuals who had an infection restricted to the lungs showed higher levels of 7-oxo-DHEA, compared to the group of patients with disseminated TB. On the other hand, the immunomodulatory effect of the above-mentioned steroid compounds was tested stimulating PBMCs from HIV-TB and HD with heat-killed gamma-irradiated Mtb H37Rv. Cell proliferation and cytokine production were studied. Interestingly, 7-oxo-DHEA at its most effective concentration (1x10-6M) was able to increase cell proliferation and to modulate a Th1-like cytokine profile, by increasing the levels of IFN-γ and TNF-, without suppressing the necessary action of IL-10 (a regulatory cytokine) and reducing the secretion of IL-17A (pro-inflammatory). With the aim to explore if hormones could promote a Th1 phenotype over a regulatory profile, the relationship between IFN-, IL-17A, TNF- and IL-10 was studied. The effect exerted by 7-oxoDHEA was manifested by significant increase in the levels of IFN- and TNF- over those of IL-10 and by an augmented IFN-/IL-17A ratio in HIV-TB and HD, suggesting that 7-oxo-DHEA could articulate an immunoprotective response instead of a pathological condition. Based on the promising results found in 7-oxo-DHEA, and in order to deepen the knowledge regarding its immunomodulatory function, two additional studies were performed. Initially, human macrophage THP-1 and murine alveolar MH-S cell lines were infected with Mtb strain H37Rv in the presence of the hormone. It was observed that cultures exposed to 7-oxo-DHEA showed a higher phagocytic capacity and an improved control of bacterial growth, associated with a profile of pro-inflammatory cytokines. Finally, a pre-clinical trial using a murine model of progressive pulmonary tuberculosis was performed. BALB/c mice were infected with Mtb strain H37Rv and treated with 7-oxo-DHEA (15, 50 or 200 g/day, 3 times per week) from day 60 postinfection. The results showed that after one-month treatment, the bacterial load in lung and spleen from infected mice had decreased significantly. The results of this PhD thesis work allowed us to conclude that 7-oxo-DHEA seems to be a potent immunoprotective compound. Therefore, it is proposed that 7-oxo-DHEA could be used as an adjuvant to improve TB treatment, shortening therapy times and improving the quality of life of patients, particularly those immunocompromised, such as HIV+ individuals.