Estudio de los mecanismos moleculares y celulares de la entrada y propagación del Virus de la Diarrea Viral Bovina

Abstract

El virus de la diarrea viral bovina (BVDV) es un pestivirus patógeno del ganado vacuno cercanamente relacionado al virus de la hepatitis C (HCV) dentro de la familia Flaviviridae. La infección con BVDV reduce la productividad causando pérdidas económicas para la industria ganadera. La partícula viral comprende una membrana lipídica asociada a las glicoproteínas de envoltura Erns, E1 y E2, que rodean a la nucleocápside que contiene el genoma viral, el cual consiste en una única molécula de ARN simple cadena de polaridad positiva. E2 es el principal determinante antigénico en el animal infectado y produce una respuesta inmune con anticuerpos neutralizantes contra BVDV. A su vez cumple un rolfundamental para la entrada del virus a la célula huésped dado que interacciona con receptores en la superficie de la célula que median la endocitosis de la partícula viral, y forma un complejo con E1 que es esencial en la fusión de la envoltura del virus con la membrana del endosoma en medio ácido para liberar el genoma de ARN en el citoplasmade la célula infectada. La reciente determinación de la estructura cristalina de E2 ha abierto nuevas perspectivas en el estudio del mecanismo molecular de la entrada de BVDV. En este trabajo de tesis se desarrollaron nuevas herramientas genéticas y moleculares con elobjetivo de estudiar el mecanismo de entrada y propagación de BVDV, haciendo foco fundamentalmente en el rol protagónico de la glicoproteína de envoltura E2.En la primera parte de este trabajo se empleo genética invesa para producir una versión recombinante de BVDV que expresa GFP en el citoplasma de células infectadas. Utilizando este virus desarrollamos ensayos basados en la detección de GFP por microscopia de fluorescenica y citometría de flujo mediante los que pudimos demostrar que la expresión de dicha proteina funciona como reportero de la replicación de BVDV. Por otro lado se desarrolló un sistema de expresión y marcación sitio específica con biotina in vivo para la proteína de envoltura viral E2 que permitió producir una proteína recombinante marcada homogéneamente. La unión especifica de esta proteína recombinante a células susceptibles y su capacidad de bloquear la entrada de BVDV,sugieren que la misma mantiene un plegamiento y funcionalidad correctos.A partir de la bibliografía referida a las funciones de E2 y basándose en un análisis de conservación de secuencias se identificaron en la estructura de la proteína posibles motivos funcionales. En particular, analizamos el rol de un motivo de estructura tipo β-hairpin expuesto al solvente como posible responsable de la interacción con receptores. Sediseñaron mutaciones en dicha region, las cuales en el contexto de la proteína soluble resultaron en una disminucion de su capacidad de bloquear la entrada de BVDV. A continuación, se generó un virus recombinante portando las mutaciones en el β-hairpin y se observó que la infectividad de dicho virus está severamente disminuida con respecto alvirus, indicando que dicha región está involucrada en la interacción con receptores celulares.En la segunda parte de este trabajo se construyó una pareja de virus recombinantes citopático y no citopático que expresa una versión de E2 en fase con la proteína fluorescente mCherry en su extremo amino terminal. A través de la detección de mCherry se pudieron identificar células infectadas y seguir así la propagación de la infección en células vivas. Empleando esta herramienta nos propusimos estudiar si BVDV tiene la capacidad de propagar en forma directa de célula a célula. Para esto se diseñaron ensayos de co-cultivo, donde se pudo observar la propagación de la infección viral desde células productoras de virus hacia células blanco aun en presencia de suero neutralizante en el medio. De esta forma demostramos por primera vez la existencia de propagación célula a célula en pestivirus. Con estas mismas herramientas comenzamos a estudiar cuales son los factores virales y celulares que median este tipo de propagación, hallando que la misma depende de la interacción de E2 con receptores específicos.