Análisis a gran escala de pares de interacción de Trypanosoma cruzi mediante la técnica bioluminescence resonance energy transfer

Abstract

En trabajos previos realizados en Trypanosoma cruzi, nuestro grupo ha caracterizado distintos pares interactuantes y sus interfases de interacción: SF1/U2AF65 y SF3b155/p14 del complejo trans-splicing, CPSF30/FIP1 del complejo de poliadenilación, Mago/Y14 del Exon Junction Complex e interacciones entre proteinas P de la protuberancia del ribosoma. A fin de utilizar estas interacciones como potenciales blancos terapéuticos, nuestro objetivo consistió en analizar estos pares de interacción mediante la técnica Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET). Para ello, cada una de las proteínas fue clonada en fusión con la Green Fluorescent Protein y con la Enhanced Yellow Fluorescent Protein, tanto en orientación N-terminal, como en C-terminal. Luego, todas las posibles combinaciones de cada par de interacción, fueron analizadas por BRET. En el caso de las proteínas ribosomales P, observamos en células señales positivas de interacción en al menos alguna de todas las combinaciones analizadas para cada par interactuante. Sin embargo, ninguna de las combinaciones correspondientes al par P0/P2β, resultaron positivas. Estos resultados correlacionan con los reportados anteriormente. El resto de las interacciones analizadas, también presentaron resultados positivos al testear las combinaciones en células. Más aun, al probar algunas combinaciones utilizando extractos proteicos, encontramos que las más fuertes se dan entre los pares Mago/Y14, SF3b155/p14 y CPSF30/FIP1. En este trabajo hemos validado todas las interacciones previamente descriptas por otros ensayos, mediante el uso de una técnica altamente sensible y útil para el análisis a gran escala, como lo es el BRET. Además, con esta metodología, los pares de interacción que arrojaron altas señales tanto in vitro como en células, resultan candidatos interesantes sobre los cuales testear bibliotecas de compuestos a fin de encontrar alguno que logre interrumpir la interacción.