Estudio y desarrollo de nuevos inmunosensores electroquímicos para la detección y cuantificación de la bacteria enterotoxicogénica Escherichia coli

Abstract

En la especie porcina, Escherichia coli enterotoxigénica F4 (K88) (ETEC F4) es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en las diarreas neonatal (DNN) y postdestete (DPD), que generan importantes pérdidas económicas debido a sus altas tasas de mortalidad y morbilidad.En la presente Tesis Doctoral, se desarrollaron un sensor bioelectroanalítico y un magneto-inmunosensor electroquímico para la detección y cuantificación de ETEC F4 en muestras de materia fecal porcina de manera simple, rápida y económica.El sensor bioelectroanalítico consistió en un electrodo de carbono vítreo modificado con una dispersión de nanotubos de carbono de pared múltiple, en solución acuosa conteniendo 1 % de nafión. La respuesta electroquímica de suspensiones de ETEC F4 por voltamperometría de onda cuadrada (VOC) consistió en un pico de oxidación irreversible a un potencial cercano a 0,67 V vs Ag/AgCl. A fin de optimizar las condiciones para la detección, se analizaron los posibles mecanismos mediante los cuales se produce la transferencia directa de electrones entre la bacteria y el electrodo. Se utilizaron suspensiones de bacterias vivas y también inactivadas por autoclave, preparadas en solución amortiguadora de fosfatos salinos (SAFS). Los mejores resultados en cuanto a sensibilidad e intervalo lineal se obtuvieron con suspensiones de bacterias inactivadas en autoclave. Las muestras de materia fecal porcina consistieron en una dilución 1/5000 (g materia fecal / mL SAFS), centrifugada en condiciones leves (10 min a 500 rpm) y la posterior inactivación del sobrenadante en autoclave. Se realizaron agregados sucesivos de suspensiones ETEC F4 al sobrenadante de las muestras y se observó la respuesta electroquímica con concentraciones de ETEC F4 comprendidas en el intervalo de 2,00 x 103 ? 2,00 x107 UFC mL-1. El límite de detección (LD), límite de cuantificación (LC) y la desviación relativa estándar fueron 6 x 104 UFC mL-1, 2 x 105 UFC mL-1 y 20 %, respectivamente.Por otra parte, para el magnetoinmunosensor electroquímico se utilizaronelectrodos de capa impresa de carbono (ECIC) y partículas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-ETEC F4. La detección se basó en la actividad de la enzima intracelular b-galactosidasa (b-gal), la cual hidroliza el sustrato p-aminofenil--D-galactopiranósido (PAFG) generando el p-aminofenol (PAF). El PAF se oxida sobre la superficie del ECIC y se detectó por VOC. Se utilizaron suspensiones de bacterias que fueron previamente incubadas con isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG), para favorecer la producción de b-gal. Para el inmunoensayo, se agregaron partículas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-ETEC F4 (PM-pAb) a las suspensiones de bacterias. Luego de una incubación y pasos de lavado, los complejos PM-pAb-ETEC F4 se resuspendieron en solución de permeabilizador sulfato de polimixina B (10 microg mL-1) y sustrato PAFG (2 mg mL-1), se colocaron sobre el ECIC y se realizó la detección por VOC. Se optimizaron las variables relacionadas con el principio de detección (tiempo de incubación con IPTG, tiempo de permeabilización, tiempo de reacción con PAFG y las concentraciones de estos reactivos) y las variables del inmunosensor (concentración de anticuerpo y volumen de partículas magnéticas). Se realizó una curva de calibrado en el intervalo de concentraciones 101 ? 107 UFC mL-1. El intervalo lineal estuvo comprendido entre 1x101 y 4x104 UFC mL-1, el LD fue 33 UFC mL-1 y la sensibilidad fue 4x102 microA mL UFC-1. Las muestras de materia fecal se prepararon diluyendo 1 g en 10 mL de SAFS y se centrifugaron 10 min a 500 rpm. Se realizaron determinaciones en el sobrenadante y sobrenadante inactivado, a los cuales se les agregaron bacterias ETEC F4 del orden de 103 UFC mL-1. El magneto-inmunosensor fue validado frente a la técnica convencional de cultivo y recuento en placas.