Transcriptómica de frutos de tomate en tres estadios principales de maduración en dos genotipos parentales y dos líneas mejoradas (RILs)

Abstract

Los experimentos se realizaron en el campo experimental “J. F. Villarino” (Zavalla, Argentina). Se utilizaron como materiales de estudio dos genotipos parentales de tomate: el cultivar domesticado Caimanta de Solanum lycopersicum L. (C) y la accesión LA0722 de la especie silvestre Solanum pimpinellifolium (P), y las variedades mejoradas ToUNR1 (R1) y ToUNR18 (R1). Los frutos fueron cosechados en tres estados de madurez: Verde Maduro (VM, estado de maduración en el que el fruto alcanza el máximo tamaño con coloración verde), Pintón (P, cuando el 10% de la superficie del fruto vira hacia el color de madurez) y Rojo Maduro (RM, estado en el que el fruto presenta más del 90% de su superficie con el color final de la madurez) de cada genotipo y donde el pericarpio del fruto fue separado inmediatamentedel fruto (del plano ecuatorial del mismo), congelado en nitrógeno líquido y almacenado a −80 °C hasta su posterior extración de ARN. Se tomaron 3 réplicas biológicas, es decir, de cada genotipo, un fruto de los tres estados de maduración (VM, Pi y RM) en 3 plantas distintas de cada material vegetal (n = 36). La extracción del ARN se llevó a cabo de acuerdo a las instrucciones del protocolo del kit Direct-zolTM RNA Miniprep Plus (Zymo Research Corporation - Cat #R2071). La calidad del ARN se verificó dos veces, tanto en espectrofotómetro (A260/A280 ratio ≥ 1.8) como en geles de agarosa al 1% p/v; la muestra que superó este doble chequeo fue enviada a secuenciar. La secuenciación mediante RNA-seq fue generada en un instrumento de secuenciación NovaSeq 6000 S1 de Illumina en la empresa Macrogen® de Corea, con el uso de la librería TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit® (Guía de preparación - Parte 15031047 - Rev. E), enviando 2 ug de ARN total en una concentración de 30 ng/ul como lo establece el laboratorio. Las lecturas generadas fueron de 2 x 101 paired-end reads (lecturas apareadas), obtenidas con la construcción de bibliotecas de tipo strand-specific con el protocolo ‘TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Guide, Part #15031047 Rev. E’. Los datos obtenidos se analizaron de la siguiente manera: los archivos del tipo FASTQ fueron enviados por el laboratorio en donde se realizó la secuenciación, y se sometieron a evaluaciones de calidad mediante la versión 0.72 del programa FastQC. Al detectar mediante esta herramienta incoherencia en los datos obtenidos, se realizó una limpieza bioinformática de los mismos mediante los software Trimmomatic y SortMeRNA. El software Trimmomatic versión 0.32.3 permitió remover aquellas secuencias que presenten contaminación con adaptadores propios de la secuenciación, descartar las lecturas que no poseen buena calidad en su secuencia, y también descartar aquellas lecturas de longitud relativamente más corta a las solicitadas (101 pb) que probablemente se originaron por artefactos de la misma corrida en el secuenciador. Por su parte, el software SortMeRNA Versión 2.1b.6 permitió filtrar y eliminar la contaminación de ARN ribosomales en datos transcriptómicos secuenciados. A las secuencias limpias se les realizó una segunda comprobación de calidad utilizando nuevamente el software FastQC antes mencionado y una vez realizado esto, se mapearon las lecturas de cada biblioteca frente al genoma de referencia de tomate mediante el uso del software HISAT2 Versión 2.1.0. El genoma de referencia de tomate pertenece al cv. Heinz 1706 de Solanum lycopersicum y fue descargado de la plataforma online Sol Genomics Network como así también la anotación génica perteneciente al mismo (Tomato Genome version SL4.0 and Annotation ITAG4.0). Una vez alineadas las lecturas frente a la referencia, se utilizó el software featureCounts Versión 1.6.3 para medir la expresión génica global en cada una de las muestras estudiadas. A partir de allí se generó la tabla aquí disponible con los conteos (sin normalizar) en cada una de las muestras secuenciadas.